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DPC4基因在肺癌中的表达及其与微血管形成和凋亡的关系
载入中...【摘要】 目的 探讨DPC4(deleted in pancreatic carcinoma locus 4，DPC4)基因在非小细胞肺癌(nonsmall cell lung carcinoma,NSCLC)中的表达及其与微血管形成和凋亡的关系。方法 利用免疫组织化学SP法检测52例NSCLC组织、19例相应的癌旁正常肺组织中DPC4、VEGF的表达，用CD34标记血管内皮细胞并计算微血管密度MVD值，应用TUNEL技术对细胞凋亡情况进行了检测并计算凋亡指数。结果 DPC4在肺癌原发灶中的阳性表达率为63.5%(33/52)，与癌旁正常肺组织中的阳性表达率89.5%(17/19)相比，DPC4阳性表达水平显著降低（P<0.05）;DPC4与组织学类型、肿瘤细胞分化程度无关（P＞0.05），但与淋巴结转移显著相关（P<0.05）。52例NSCLC中，DPC4的表达与VEGF、MVD值均呈负相关(r=-0.303, P =0.020)。DPC4阳性组凋亡指数(apoptotic index,AI)值明显高于DPC4阴性组（P<0.05）。结论 DPC4的低表达可能是肺癌发生过程的早期事件，并可通过直接或间接的作用促进肺癌血管生成，从而促进肺癌的淋巴结转移，DPC4的高表达可能促进细胞的凋亡。
【关键词】 DPC4 肺癌 免疫组化 血管生成 凋亡
0 引言
DPC4(deleted in pancreatic carcinoma locus 4，DPC4)是一种新的肿瘤抑制基因，其首先由Hahn SA等[1]于1996年在Science上报道，其蛋白产物Smad4是转化生长因子β(TGFβ)超家族受体的直接底物，而TGFβ具有抑制细胞生长和肿瘤转移等多种功能[2]，最近的研究显示DPC4除了在TGFβ信号传导途径中的中心作用以外，还具有一些独立于TGFβ的功能。如DPC4具有调节细胞粘附和侵入的潜在功能，以及抑制肿瘤组织的血管增殖和促进凋亡等[3]。但DPC4在NSCLC中的表达尤其与肿瘤微血管形成和凋亡的关系，国内外相关报道甚少。本研究应用免疫组化SP法检测了52例肺癌组织和19例相应的癌旁正常组织DPC4基因的蛋白表达，以探讨其在肺癌发病机制中的作用及其与微血管形成和凋亡的关系，为今后以DPC4基因为靶点对肺癌进行基因治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 标本来源
标本来自湖北省肿瘤医院和武汉大学附属医院2000年3月至2003年7月肺癌手术患者52例，其中鳞癌25例，腺癌27例。高分化癌14例，中分化癌18例，低分化癌20例。伴淋巴结转移17例。另取癌旁正常肺组织19例。全部标本经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，制成4μm厚连续切片。
1.2 试剂和方法
鼠抗人DPC4、VEGF和CD34单克隆抗体购自MaximBio公司，均为即用型。免疫组化SP Kit为MaximBio公司产品。实验步骤按试剂盒说明进行，用PBS代替一抗作阴性对照，以已知阳性片作阳性对照，用DAB显色，苏木精复染。
1.3 免疫组织化学结果判断
DPC4和VEGF阳性颗粒主要分布于正常支气管上皮细胞和肿瘤细胞的胞浆（见图1、2），以细胞浆内出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。显微镜下观察DPC4和VEGF蛋白的分布、阳性强度和阳性率。先按染色强度打分：0分为无色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色，染色强度需与背景着色相对比；再按阳性细胞所占百分比打分：0分为阴性，1分为阳性细胞≤10%，2分为11%～50%，3分为51%～75%，4分为＞75%，染色强度与阳性细胞百分比的乘积≥2分为免疫反应阳性（+）。
MVD计数: 按照Weidner的标准[3]，在低倍镜下选取肿瘤微血管数量最丰富的区域，200倍视野范围计算3个视野的微血管数目，取其平均值作为MVD(±s)， 微血管判断标准是以肿瘤区内染成棕黄色单个内皮细胞或内皮细胞簇， 均作为一个血管计数， 若有管腔大于8个红细胞大小及带有较厚肌层的血管或坏死区域的血管均不予计数。
1.4 细胞凋亡检测
采用改良的TdT介导的dUTPbiotin切口末端标记原位检测法。标记液及抗体购自德国Boehringer Mannhein公司。凋亡阳性染色位于细胞核,呈棕黄色。主要表现为核浓缩或核质呈均匀的染色,染色质边聚,无白细胞浸润（见图3）。随意挑选10个高倍镜视野下阳性细胞与总细胞比值为AI。 1.5 统计学处理
采用SPSS（11.5版）进行统计学分析，DPC4的表达与不同临床病理参数的关系采用χ2和Fisher’s精确检验，DPC4和VEGF的关系采用Spearman相关分析，DPC4与MVD和AI的关系采用t检验。
2 结果
2.1 NSCLC中DPC4的表达
DPC4在癌旁正常肺组织和肺癌原发灶中的阳性表达率分别为89.5% (17/19)、63.5%(33/52) (P＜0.05）。由表1可知，在肺腺癌中DPC4的阳性率明显高于肺鳞癌，但P>0.05； 随着分化程度的降低，DPC4的阳性表达率呈下降趋势，但P>0.05；有淋巴结转移的肺癌组DPC4阳性率显著低于无淋巴结转移组P＜0.001。表1 NSCLC中DPC4的表达与临床病理特征的关系
2.2 NSCLC中DPC4表达同VEGF表达和MVD 间的关系
VEGF表达阳性细胞多位于肿瘤的边缘(图2)。由表2可知，VEGF在DPC4阴性表达组的阳性率明显高于DPC4阳性组，二者呈明显的负相关(r=-0.303，P=0.020)。CD34阳性产物定位于肿瘤间质的血管内皮细胞(见图4) ， 免疫组化结果发现， 新生血管热点区在肿瘤侵袭边缘的间质中分布密度明显高于肿瘤的中央区域。NSCLC中MVD计数为17.20～83.16，平均值为53.42±13.15，DPC4表达阳性组MVD值为43.74±7.25， 显著低于DPC4表达阴性组61.77±7.09，差异有高度显著性（t = 8.474，P＜0.001），见表2。
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