【摘要】 目的研究以HER2 mRNA为靶点的反义硫代脱氧寡核苷酸（SODNs）HA6722对HER2过表达乳腺癌细胞株MDAMB453体外增殖的抑制作用，及HA6722对肿瘤细胞HER2表达的影响。方法选择HER2过表达的MDAMB453细胞与HER2低表达的MDAMB231细胞，MTT法观察SODNs对肿瘤细胞增殖的影响，免疫细胞化学（ICC）与RTPCR方法研究SODNs对细胞HER2蛋白及mRNA表达的影响。结果 HA6722可以剂量依赖方式抑制MDAMB453细胞的体外增殖，IC50值（41.8±8.1nmol·L-1, n=5, mean±s）显著低于对照序列Scramble6722（IC50=489.4±12.1nmol·L-1, n=5, P<0.01）。HA6722在蛋白水平与mRNA水平显著抑制MDAMB453细胞中HER2的表达；HA6722对MDAMB231细胞的体外增殖无显著影响（IC50=476.7±17.6 nmol·L-1, n=5，P＞0.05）。结论 HA6722可序列特异性地抑制HER2过表达乳腺癌细胞的体外增殖，其抑制增殖作用与靶细胞HER2表达下调有关。

【关键词】 反义寡核苷酸乳腺癌 HER2 mRNA

0 引言

乳腺癌的发生、发展涉及多基因的异常。HER2/neu（又称CerbB2）基因的异常扩增见于30%左右的乳腺癌患者。现已明确，HER2/neu基因的异常扩增或HER2受体的过表达是一种不良的预后指标[1]。反义疗法是在转录水平以反义寡核苷酸特异性结合靶mRNA，激活RNase H，降解mRNA, 阻断相应功能蛋白的表达。有研究表明[2，3], 反义寡核苷酸可以抑制HER2受体的表达，进而抑制乳腺癌细胞的增殖。本研究采用本研究室设计合成的HER2特异性硫代反义寡核苷酸HA6722，观察了其对不同HER2表达水平的乳腺癌细胞株增殖活性的影响，并在mRNA和蛋白水平观察了其对HER2的影响。

1 材料与方法

1．1 细胞系及培养

本研究采用的细胞株有：MDAMB453（HER2过表达），细胞培养所需的培养基为L15（Gibco,BRL）内含10%的胎牛血清（FCS，Hyclone），置37℃、不含CO2的培养箱中培养；MDAMB231（HER2低表达）的体外培养采用RPMI1640（Gibco,BRL）培养基，内含10%的胎牛血清（FCS，Hyclone）,置37℃、含体积分数为5%的CO2培养箱中培养传代。

1．2 硫代反义寡核苷酸的合成

靶向HER2 mRNA反义寡核苷酸HA6722、Scramble6722序列均为含20个核苷酸的寡聚核苷酸，全程硫代修饰，由北京赛百盛基因技术有限公司合成。序列如下：

HA6722： 5′CAG CAG CCG AGC CAG CCC GA3′

Scramble: 5′TCG GGC TGG CTC GGC TGC TG3′

琼脂糖凝胶电泳结果表明上述反义寡核苷酸纯度符合要求。上述反义寡核苷酸以无血清无抗生素的L15或RPMI1640培养基溶解成浓度为25μmol·L－1的溶液，过滤除菌，-20℃储存，临用时稀释至所需浓度。

1．3 噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）法检测细胞活性取对数生长期的上述细胞，以不同数量接种96孔培养板（Costar,USA）,接种数量分别为：MDAMB453 5×104cells/孔、MDAMB231 2×104cells/孔，为避免“周边效应”，培养板的周边孔弃用。待细胞生长至80%～90%融合时，用脂质体2 000将不同浓度的HA6722, Scramble6722等硫代寡核苷酸转染细胞4～6h，随后继续培养24～72h，倾去培养液，加新鲜配置的MTT溶液（0.5mg/ml）200μl, 细胞在37℃，含有5 %（MDAMB453细胞的培养不需CO2）的培养箱中继续孵育4h，吸去MTT溶液，每孔加200μl DMSO, 轻轻震荡20～30min，酶联仪测定光吸收值（OD值）。

1．4 免疫细胞化学

以脂质体（LipofectamineTM 2000, Invitrogen）2000将终浓度为200 nM 的HA6722, Scramble6722对照序列转染MDAMB453及MDAMB231 36h后，以免疫组化方法检测HER2受体表达。具体方法见免疫组化试剂盒操作说明（中山公司）。简言之，将细胞涂片在枸橼酸缓冲液(6.4M枸橼酸二钠，pH 6.0)中以 95℃ 15min进行抗原修复，室温下冷却20min，用Tris 缓冲液（pH 7.6）冲洗涂片3min×3次，然后过氧化氢室温封闭5min，再按上述方法洗涤。涂片在37℃下用HER2单克隆抗体(鼠抗人，Santa Cruz, USA)孵育60min，再用二抗 (羊抗鼠，Santa Cruz, USA)以同样的条件孵育30min。用缓冲液冲洗切片3min×3次，再用铬精底物溶液(3, 3’二氨基联苯胺)进行核染色。最后以苏木精染色计算着色深度。着色深度分为0 (基本等同于阴性染色), 1+ (轻度着色), 2+ (中度着色)及3+ (重度着色)。

1．5 逆转录多聚酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction, RTPCR）

以浓度为200nmol·L-1的硫代反义寡核苷酸HA6722、Scramble6722序列分别转染MDAMB453、MDAMB231乳腺癌细胞24小时后，遵照试剂说明书（RNA RTPCR试剂盒，广州璐晶）提取细胞总RNA，Backman紫外分光光度计测定光吸收值（OD值），计算RNA含量。人类特异的HER2及内标(glyceraldehydes-3-phosphate，G3PDH) 引物如下：

HER2 上游： 5’CAA TGG AGA CCC GCT GAA C3’; 下游: 5’CAG TGC GCG TCA GGC TCT 3’

G3PDH 上游: 5’ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC 3’; 下游: 5’TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA 3’

引物由北京赛百盛公司合成。反应条件为：反转录及第一次循环：预变性1循环 55℃ 30min， 94℃ 2min；PCR 30个循环：94℃ 25sec，56℃ 30，72℃ 35sec；产物扩增及第二次循环：94℃ 1min；PCR 30个循环：94℃ 25sec，56℃ 30sec，72℃ 35sec；最后是2min的延伸。反应产物在1.2%的琼脂糖 (Gibco) 凝胶中进行电泳，之后在紫外灯下扫描拍照；上述细胞在不经硫代反义寡核苷酸转染的情况下，分别提取RNA，按同样方法操作，以检测HER2 mRNA的基础表达水平。

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