1.6 IRES2EGFP基因序列获得及鉴定
取10ng pIRES2EGFP载体做模板，P3、P4为引物进行PCR扩增，反应体系：P3、P4各0.5μM、2.5 U Pfu DNA聚合酶、200μM dNTP、1×PCR Buffer，50μl反应体系；反应条件：94oC预变性10min，94oC变性30s、60oC退火45s、72oC延伸90s共30个循环，再向PCR反应管中加入1.25 U Taq DNA聚合酶，72oC终末延伸15min。TA克隆、阳性重组质粒筛选、测序鉴定同上，除用M13通用引物外，还用P5引物测序，将1 346bp长度的DNA序列测通，将其重组质粒命名为pMDIRES2EGFP。
1.7 pLXSNIRES2EGFP表达载体构建及鉴定
用XhoⅠ和BamHⅠ双酶切测序鉴定正确的pMDIRES2EGFP重组质粒，跑1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收纯化1 350bp左右的条带，此为两端带XhoⅠ和BamHⅠ位点的IRES2EGFP基因序列。同样，用XhoⅠ和BamHⅠ双酶切pLXSN载体质粒，胶回收纯化5.9kb的线性化的载体，其两端同样带有XhoⅠ和BamHⅠ位点。用DNA Ligation Kit将IRES2EGFP基因序列通过XhoⅠ和BamHⅠ位点定向与线性化的pLXSN载体连接，连接时其摩尔数之比控制在4:1左右。转化、筛选同上。最后XhoⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定。此载体命名为pLXSNIRES2EGFP。 1.8 pLBaxSNIRES2EGFP表达载体构建及鉴定
用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切测序鉴定正确的pMDbax重组质粒，胶回收纯化600bp左右的条带，此为两端带EcoRⅠ和XhoⅠ位点的bax基因序列。同样，用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定过的pLXSNIRES2EGFP载体质粒，胶回收纯化7.2kb的线性化的载体，其两端同样带有EcoRⅠ和XhoⅠ位点。用DNA Ligation Kit将bax基因序列通过EcoRⅠ和XhoⅠ位点定向与线性化的pLXSNIRES2EGFP载体连接。最后EcoRⅠ、XhoⅠ和BamHⅠ三酶切鉴定。此为bax基因的逆转录表达载体pLBaxSNIRES2EGFP。
1.9 逆转录病毒表达载体的包装及感染Hela细胞
按《分子克隆》碱裂解方法中量提取pLBaxSNIRES2EGFP质粒，用PEG8000方法再次沉淀纯化质粒，-20°C储存备用。收集PA317包装细胞至107左右在400μl培养基中，加入15μg的pLBaxSNIRES2EGFP质粒，在BTX 830电穿孔仪上做电转化，条件为：电压475V，脉冲时间1 ms，脉冲次数2，4mm电转杯。电转后补足培养基，37oC、5％CO2条件培养24h后，加G418至终浓度800μg/ml筛选，此浓度筛选2周后，挑选抗性克隆进行扩大培养，G418浓度降为200μg/ml。待其生长状态良好时，每隔48~72h收集病毒上清1次，收集重组病毒上清液以NIH 3T3细胞为靶细胞测定重组逆转录病毒滴度。Hela细胞以105细胞传代，待其长满至瓶底的70%时，加入8μg/ml Polybrene的病毒上清1ml，均匀覆盖平瓶底，每隔30min轻摇1次，至2h加入新鲜完全培养液，使Polybrene浓度降至8μg/ml，48h后1:10传代并加入含有800μg/ml G418的培养液，3周后挑取抗性克隆扩增培养，G418浓度降低至200μg/ml。
1.10 Western Blotting检测bax基因的表达
收集扩增培养的克隆细胞，用细胞裂解液裂解细胞，12 000g、10min离心去除细胞碎片，Bradford方法测细胞裂解液的蛋白含量，取25μg总蛋白样品在12.5% SDSPAGE进行电泳分离，经电转膜仪转至硝酸纤维素膜。然后用5%脱脂奶粉4oC封闭4h，弃溶液，加入用5%脱脂奶粉稀释的兔抗人Bax抗体（1:500稀释），室温轻摇1h，TBST洗膜3次，加入用5%脱脂奶粉稀释的辣根过氧化酶（HRP）偶联的羊抗兔IgG（1:5000稀释），室温轻摇1h，TBST洗膜3次后，用ECL方法显色，压片。AlphaImager2200软件成像、分析。SPSS 10.0分析实验组与对照组之间差异有统计学意义(P＜0.05)。
2 结 果
2.1 bax基因克隆
以Hela细胞来源的cDNA为模板，P1、P2为引物，52oC退火PCR扩增，PCR产物在600bp左右有带（如图2），经纯化后TA克隆至pMD18T载体上，M13通用引物测序得到其序列，经NCBI数据库BLAST比对分析，得到的PCR产物序列完全与收录号为NM_138761的bax基因的cDNA序列完全一致，说明已经成功得到bax基因的cDNA序列。
2.2 bax基因逆转录病毒表达载体的构建
采用PCR方法，从pIRES2EGFP表达载体上扩增出来的IRES2EGFP序列经测序验证，与ClonTech公司提供的完全一致，后又通过XhoⅠ和BamHⅠ酶切位点，定向与pLXSN载体连接，菌落PCR筛选后，提取阳性克隆质粒，用XhoⅠ和BamHⅠ双酶切验证应该出现两条带，在1 300bp左右处有IRES2EGFP序列，在6 000bp左右处有pLXSN线性载体序列（如图2），阳性克隆命名为pLXSNIRES2EGFP。验证正确的bax基因通过EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，定向克隆至pLXSNIRES2EGFP载体，菌落PCR阳性克隆提取质粒后用EcoRⅠ、XhoⅠ和BamHⅠ三酶切验证，琼脂糖电泳检测出现除了上述两条带外还有600bp左右的bax基因序列带（如图3所示），阳性克隆命名为pLBaxSNIRES2EGFP。说明已成功构建bax和EGFP的双基因表达的逆转录病毒表达载体。
2.3 外源bax基因的表达
将pLBaxSNIRES2EGFP载体通过PA317细胞包装后，病毒颗粒感染Hela细胞，同时以pLXSNIRES2EGFP载体作为对照，800μg/ml的G418筛选4周后，Western Blotting方法检测bax基因的表达，可见在总蛋白上样量一致的情况下，转有外源bax基因的实验组的Bax蛋白明显比对照组含量要高，表明外源bax基因成功在Hela细胞中表达。
3 讨 论
人bax基因全长6 939bp，定位于染色体19q13.3q13.4，由6个外显子组成，转录后可产生α、β、γ、δ、ε和σ 6种mRNA剪接变体，并分别编码产生6种Bax蛋白亚型[8]。Baxα是细胞中存在的主要形式并有生物活性的主要蛋白亚型。本实验的引物是根据Baxα的ORF的序列设计的，而Baxδ、ε和ζ的ORF同样包含有引物配对区域，因此，如果Baxα、δ、ε和σ四种蛋白亚型都有表达，PCR反应扩增基因时会出现4条大小不一的片段，分别为593bp、446bp、691bp和554bp。本实验结果只扩增出593bp的片段，最后测序证实为Baxα的cDNA序列，是bax基因在肿瘤细胞中的主要表达形式，与转贴于 酷文网-论文下载中心 http://www.coolwen.net
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