【摘要】 ［目的］构建带有报告基因EGFP的bax基因逆转录病毒表达载体，建立高表达bax基因的Hela细胞。［方法］通过RTPCR方法从Hela细胞克隆bax基因，根据基因工程原理，经PCR、酶切等方法构建bax基因和报告基因EGFP双基因逆转录病毒表达载体pLBaxSNIRES2EGFP，转染Hela细胞后，荧光显微镜和Western Blotting检测bax基因的表达情况。［结果］成功构建了带有EGFP的bax基因的逆转录病毒表达载体，并将其转入Hela细胞。［结论］成功建立的高表达bax基因的Hela细胞株，为探讨bax基因与放射敏感性之间的关系奠定了基础。
【关键词】 bax基因 逆转录病毒表达载体 IRES序列 载体构建
Recombinant Human bax Gene Retroviral Vector Construction and Its Expression in Hela Cells
Abstrac:［Purpose］To construct the human bax gene retroviral expressive vector with EGFP gene and obtain a Hela strain overexpressing bax gene by transfection. ［Methods］Bax gene was cloned from Hela cell with RTPCR. The retroviral vector carrying both bax and EGFP gene was constructed using PCR and enzyme digestion etc, then this new vector pLBaxSNIRES2EGFP was used to transfect Hela cell to establish a new Hela strain, and the expression of the exogenous bax gene was verified by fluorescence microscope and Western Blotting. ［Results］ The recombinant retroviral vector with exogenous bax and EGFP gene was constructed, and the recombinant vector was transfected into Hela cell. ［Conclusion］ The successful establishment of Hela cell strain that overexpresses exogenous bax gene provides the basis for further studies on the relationship between the bax gene expression and the sensitivity to radiotherapy for Hela cell.
Key words: bax gene;retroviral vector;IRES;vector construction
1993年，Oltvai等[1]发现的一种能与Bcl2共沉淀的蛋白质，其分子量为21kD，命名为Bax (Bcl2 associated X protein)，是Bcl2家族的重要的促凋亡蛋白。已有证据表明Bax作为一个重要的促凋亡蛋白，通过对凋亡调节而干预肿瘤发生、发展及预后[2]。另有文献报道，组织或培养的细胞受到放射线照射后，其bax基因表达上调，与其蛋白促进细胞凋亡有关[3]。我们在前期工作中发现，宫颈癌放疗前Bax高表达者的近期疗效优于低表达者[4]，郑建勇等[5]研究表明，bax基因高表达能够增加细胞对DNA损伤性药物阿霉素(adriamycin)的敏感性。因此，bax基因可能与DNA损伤引起的细胞凋亡有某种联系[6，7]，为此，我们采用人宫颈癌细胞Hela细胞系作为体外实验细胞，通过基因工程方法建立高表达bax基因的Hela细胞，旨在探讨其与放射线照射之间的关系。此外，还根据实验需要，将报告基因增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)基因通过内部核糖体结合位点(Internal Ribosome Entry Site，IRES)序列与bax基因串联起来，在同一个PCmv启动子下，启动两个基因的转录和表达，并且表达的两种外源蛋白互不干扰，保持原有活性。
1 材料与方法
1.1 主要材料及试剂
pLXSN逆转录病毒表达载体、pIRES2EGFP真核表达载体均为BD ClonTech公司产品；DH5α大肠杆菌细胞、PA317包装细胞、Hela细胞、NIH 3T3细胞为山东大学齐鲁医院肿瘤中心实验室提供；Pfu、Taq DNA聚合酶为上海博亚公司（BioAsia）产品；EcoRⅠ、XhoⅠ、BamHⅠ等限制性内切酶为MBI产品；兔抗人Bax一抗、羊抗兔HRP标记IgG二抗为Santa Cruz公司产品；pMD18T载体为大连宝生物公司（TaKaRa Dalian）产品；其它试剂购自上海生物工程公司（Sangon）产品。
1.2 细胞培养
PA317细胞以DMEM培养基培养，Hela细胞以RPMI 1640培养基，置37oC、5%CO2环境下培养。培养基内含10%新生牛血清、青霉素100U/ml和链霉素100μg/ml。
1.3 实验技术路线
如图1所示。
1.4 引物设计
根据GenBank数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）得到bax基因cDNA序列（收录号：NM_138761）及其相关信息，采用Oligo 6.0软件设计bax引物，序列如下：上游P1 5′GAGAATTCATGGACGGGTCCGGGGAG 3′，下游P2 5′GTCTCGAGCCTCAGCCCATCTTCTTC3′，P1人为引入EcoRⅠ酶切位点，P2引入XhoⅠ酶切位点，其PCR扩增产物预计在597bp，包含bax基因整个开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）。另外，为了从pIRES2EGFP载体上引出IRES2EGFP基因序列，又设计了一对引物P3、P4和测序引物P5，序列如下：上游P3 5′GTATCTCGAGATTAAGATCTTCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCC3′、下游P4 5′CGGGATCCTTTACTTGTACAGCTCGTCCAT3′、P5 5′ATG GTGAGCAAGGGCGAGGAG 3′。P3引入XhoⅠ酶切位点， P4引入BamHⅠ酶切位点，扩增产物预计为1346 bp。
1.5 bax基因克隆及鉴定
采用异硫氰酸胍一步法从培养Hela细胞中提取总RNA，取1μg总RNA，按照MMLV逆转录酶操作说明书，转录成cDNA第一链，取2μl做模板，P1、P2为引物进行PCR扩增，反应体系：P1、P2各0.5μM、2.5UPfu DNA聚合酶、200μM dNTP、1×PCR Buffer，50μl反应体系；反应条件：94oC预变性10min，94oC变性30s、52oC退火45s、72oC延伸60s共35个循环，再向PCR反应管中加入1.25U Taq DNA聚合酶，72oC终末延伸15min，使扩增产物5′端加A，以方便TA克隆。50μl PCR产物跑制备电泳，胶回收纯化PCR产物，按照pMD18T载体说明书进行TA克隆，转化感受态DH5α，涂布LB+Amp抗性平板，菌落PCR筛选、酶切初步鉴定阳性重组质粒pMDbax，然后用ABI BigDye 3.1测序试剂盒、M13通用引物做测序PCR，在ABI Prism 3100Avant遗传转贴于 酷文网-论文下载中心 http://www.coolwen.net
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