【摘要】 ［目的］ 探讨hTERT,siRNA对GBC,SD端粒酶活性、琥珀酸脱氢酶（SDH）活性、侵袭、hTERT mRNA、hTERT蛋白的作用及其相关机制。［方法］在质粒pGCsi,H1/GFP,hTERT干扰后，采用端粒酶TRAP、半定量RT,PCR和Western blot方法检测GBC,SD端粒酶活性、hTERT基因和β,catenin基因mRNA、蛋白质表达水平。四甲基偶氮唑盐（MTT）光吸收法检测SDH活性，运用Transwell小室了解癌细胞侵袭情况。［结果］ pGCsi,H1/GFP,hTERT对GBC,SD端粒酶活性、SDH活性、侵袭、hTERT mRNA、hTERT蛋白均有抑制作用并随浓度升高而增强。pGCsi,H1/negative对上述指标无明显抑制作用，与pGCsi,H1/GFP,hTERT抑制作用比较差异有统计学意义（P<0.01）。［结论］ pGCsi,H1/GFP,hTERT通过降低hTERT mRNA及蛋白表达降低，进而抑制端粒酶、SDH活性及其侵袭力。
【关键词】 胆囊肿瘤 RNA干扰 基因 蛋白质 hTERT β,catenin
Inhibitory Effect of hTERT,siRNA on Telomerase Activity Cell Proliferation and Migration in Gallbladder Cancer Cells
2.Huaian Forth Hospital of Suzhou Medical College, Huaian 223300, China）Abstract： ［Purpose］ To explore the of hTERT,siRNA effect on GBC,SD cell telomerase activity，SDH activity， invasion efficiency, hTERT mRNA and hTERT protein and their mechanisms. ［Methods］ Telomerase activity，mRNA and protein of hTERT and β,catenin in GBC,SD were detected by telomerase TRAP，RT,PCR and Western blot techniques，respectively; SDH activity, by MTT; and invasion assay by Transwell chamber after GBC,SD cells were interfered in pGCsi,H1/GFP,hTERT vector. ［Results］ pGCsi,H1/GFP,hTERT could inhibit GBC,SD cell telomerase activity，SDH activity，and invasion efficiency，expression of hTERT mRNA and protein. The inhibition effect was correlated with increase of pGCsi,H1/GFP,hTERT vector concentrations. pGCsi,H1/negative vector had no inhibition on above indexes. A statistically significant difference existed between pGCsi,H1/GFP,hTERT vector and pGCsi,H1/negative vector (P<0.01). ［Conclusion］ pGCsi,H1/GFP,hTERT can inhibit telomerase activity，SDH activity and invasion by down regulating the expression of mRNA and protein of hTERT.
Key words: gallbladder neoplasms; RNA interference; gene; protein; hTERT; β,catenin
β,catenin与胆囊的恶性病变密切相关，端粒酶、hTERT、β,catenin在人胆囊癌细胞系呈阳性表达，其中，hTERT在胆囊癌中阳性表达率为84.1%，它们可提示胆囊癌细胞的生物学特性，影响胆囊癌细胞的增殖、运动和侵袭力[2，3]，因此，以hTERT为靶点，对胆囊癌细胞的体外干预研究将有助于为胆囊癌的治疗提供一条新途径。本研究将应用hTERT RNAi技术对GBC,SD细胞代谢、生长、侵袭和端粒酶活性进行观察，同时了解其对hTERT和β,catenin的作用，并探讨其相关机制。
1 材料与方法
1.1 材 料
胆囊癌细胞株GBC,SD购自中国科学院上海分院细胞生物研究所，DH5α由复旦大学上海医学院生化教研室提供，pGCsi,H1/GFP,hTERT（h1）和pGCsi,H1/negative（h2）质粒购自上海吉凯基因公司，其中h1质粒含有hTERT mRNA特异片段，GenBank编号NM_003219，1745bp~1764bp，而h2质粒含有的是随机片段。
1.2 方 法
1.2.1 质粒制备
按照上海生工SK1192、SK1244质粒抽提试剂盒的方法筛选制备质粒，经上海博亚公司测序，鉴定正确后用于基因转染。
1.2.2 胆囊癌细胞株的培养
用含10％胎牛血清DMEM，在37℃、5％CO2培养箱中培养。
1.2.3 质粒转染
采用阳离子脂质体转染法。将5×104个细胞转接于六孔板内，培养48h。将质粒—脂质体复合物转染至细胞中（质粒：脂质体=1：5），37℃、5%CO2条件下在无血清、无抗生素的培养液中培养6h后加新鲜10％FCS的培养液至3ml/孔，2d后用于实验。
1.2.4 端粒酶活性检测
按照端粒酶华美公司TRAP,Hyb 试剂盒的方法测定端粒酶活性（OD值）。
1.2.5 RT,PCR
用上海生工UNIQ,10柱总RNA抽提试剂盒提取总RNA，RNA定量采用紫外分光光度仪，取1μg的RNA，加逆转录酶MMLV（Gibco）200U，按随机六聚脱氧核苷酸引物合成法合成cDNA。 hTERT和β,catenin基因扩增的引物及内对照β,actin引物均由上海生工合成，其序列如下：
hTERT上游引物：5＇,CGGAAGAGTGTCTGGAGCA,3＇
hTERT下游引物：5＇,CGACGTAGTCCATGTTCAC,3＇
β,catenin上游引物：5＇,AAAGCGGCTGTTAGTCACTGG,3＇
β,catenin下游引物：5＇,GACTTGGGAGGTATCCACATCC,3＇
β,actin上游引物：5＇,CATCTTCCAGGAGCGAGATC,3＇
β,actin下游引物：5＇,GGGATGATGTTCTGGAGAG,3＇
1.2.6 Western印迹分析
常规离心癌细胞，用RIPA缓冲液重悬细胞团块，冰浴条件下分别加蛋白酶抑制剂PMSF（终浓度为100μg/ml）、亮抑蛋白酶肽（终浓度为10μg/ml）、Aprotinin（终浓度10μg/ml），冰浴作用30min。然后12 000r/mim 4℃离心10min，分离细胞裂解液上清，用Bio,Rad公司蛋白质定量试剂确定各蛋白质浓度。在固定蛋白质浓度条件下，进行100～120g/LSDS,PAGE，然后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。印迹膜分别用一抗（1:1000稀释）作用；再用HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗（1:2000稀释）作用。蛋白质信号检测根据ECL,Western印迹检测试剂盒说明进行，用Alphalmager 2000 软件分析。转贴于 酷文网-论文下载中心 http://www.coolwen.net
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