【摘要】 ［目的］ 探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠（PB）体外对人肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响。［方法］不同浓度苯丁酸钠处理HepG2，应用MTT比色法观察苯丁酸钠对HepG2的生长抑制作用，落射荧光显微镜、DNA电泳和流式细胞仪观察HepG2的凋亡，Western blot检测苯丁酸钠处理前后HepG2细胞中Bcl-2、Bax蛋白表达水平的变化。［结果］ 苯丁酸钠2mmol/L、4mmol/L、8mmol/L作用48h对细胞的抑制率分别为19.41%、39.03%、42.19%，作用72h对细胞的抑制率分别为27.42%、57.11%、70.31%，并诱导细胞凋亡；4mmol/L苯丁酸钠作用HepG2 48h细胞凋亡率明显高于对照组。落射荧光显微镜和DNA电泳均观察到苯丁酸钠作用后HepG2细胞出现凋亡细胞的特征性变化。苯丁酸钠处理HepG2后Bcl-2蛋白表达减少，Bax蛋白表达增加。［结论］ 苯丁酸钠体外抑制HepG2增殖并促进其凋亡，其作用机制可能是通过降低细胞内的Bcl-2蛋白，增加细胞内Bax蛋白而实现的。
【关键词】 肝肿瘤
近年来越来越多的研究资料表明组蛋白去乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠（PB）对白血病、淋巴瘤以及多种实体瘤具有诱导分化和治疗作用[1~4]，同时作为一种诱导分化恶性肿瘤的新药，苯丁酸钠具有广谱、高效、低毒的特性[5]。我们在实验中观察了苯丁酸钠对人肝癌细胞HepG2的作用，探讨苯丁酸钠对HepG2增殖和凋亡的影响及其机制。
1 材料与方法
1．1 细胞培养
HepG2细胞购自山东省医学科学院细胞室。培养基为含10％胎牛血清的RPMI1640（Gibco公司产品），置于37°C 5%CO2的孵箱内培养。48h传代，0.25%的胰酶、 0.02%EDTA（乙二胺四乙酸二钠）消化。取对数生长期的细胞进行实验。
1．2 药 物
苯丁酸钠购自ALEXIS，用RPMI1640培养基溶解为20mmol/L浓度备用。
1．3 四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色实验
将HepG2细胞悬液浓度调整为5×104/ml，每孔200μl接种于96孔板，实验组分别加入不同浓度的苯丁酸钠，对照组不加药，另设空白对照孔（只加培养基，无细胞），每组设三个平行重复孔。继续培养，分别在48h、72h各取三孔加入MTT（5mg/ml）20μl，放置孵箱内4h后弃上清加入10%的SDS（十二烷基磺酸钠）200μl，过夜。震荡15min，用全自动酶标仪（Denley Drangon Wellscan MK2）检测570nm处的吸光度值（A值）。抑制率（%）=（A对照-A实验）/（A对照-A空白）×100%。
1．4 荧光染色观察细胞凋亡
常规收集对照组、苯丁酸钠处理组细胞，4℃ PBS洗涤2次。加入荧光染料Hoechst33342（Anaspec产品）至终浓度为2.5μg/ml，37℃避光孵育染色30min，取细胞悬液滴于清洁的载玻片，盖上盖玻片，落射荧光显微镜（JEOL-1200EX型）下观察细胞。
1．5 流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡
对数生长期的细胞用无血清的RPMI1640培养24h同步化后，分组干预48h。收集不同处理组细胞，4℃ PBS洗涤2次，计数，调整细胞浓度为1×106个/ml，取100μl细胞悬液与含1%RNA酶的Tis-HCl缓冲液混匀共同孵育10min，加入碘化丙啶（PI）和异硫氰酸荧光素（flucresceinisothiocyanate，FITC）标记的磷脂酰结合蛋白（AnnexinV）各5μl混匀，避光37℃孵育30min，FCM（FACScan美国BD公司产品）检测，凋亡细胞AnnexinV-FITC（+）PI（-），正常活细胞AnnexinV-FITC（-）PI（-），坏死细胞AnnexinV-FITC（+）PI（+），利用Cell Quest功能软件进行参数获取和数据分析。
1．6 DNA电泳
收集对照组，苯丁酸钠处理组细胞各5×107，4℃PBS洗涤2次，采用常规的蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提和乙醇沉淀法。提取出的DNA用2%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色AlphalmagerTM 2200数字电泳凝胶成像系统成像分析。
1．7 Western印记法检测Bcl-2、Bax表达蛋白
收集约5×107的细胞，PBS洗涤2次，细胞裂解液（50mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，1g/L SDS，1mM DTT，10ml/L Np-40，10g/L脱氧胆酸钠，25mg/L亮抑素，25mg/L胰蛋白酶抑制剂，1mM PMSF）提取细胞总蛋白。蛋白定量采用BCA法。调节每份样品浓度，加入等体积2×SDS加样缓冲液，煮沸5min。每孔加样20μg蛋白质，经SDS-PAGE电泳后转膜，与鼠抗人Bcl-2（C-2）、鼠抗人Bax(N-20)单克隆抗体37℃温育2h，4℃过夜。与碱性磷酸酶标记的兔抗鼠IgG 37℃温育1h，加入ECL化学发光试剂，暗室显色1min，X线片曝光，利用AlphalmagerTM 2200图像处理软件对结果进行辉度扫描，计算电泳条带的积分吸光值。以上抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，显色剂由武汉博士德公司提供。
1．8 统计学处理
每次实验至少重复3次，计量数据以x±s表示，统计学分析采用SPSS软件进行one-way ANOVA和Student t检验，P＜0.05为差异有显著性。 2 结 果
2．1 苯丁酸钠对细胞生长的抑制作用
苯丁酸钠明显抑制HepG2细胞的生长，见表1。
2．2 苯丁酸钠诱导HepG2凋亡
荧光染料Hoechst33342染色结果显示落射荧光显微镜下观察对照组HepG2细胞核染色均匀，绝大多数细胞核可见淡蓝色荧光，苯丁酸钠4mmol/L作用48h后HepG2细胞出现细胞核变小，染色质聚集呈不均匀块状并发出粉红色荧光，部分碎裂成凋亡小体。苯丁酸钠可诱导HepG2凋亡，见图1。转贴于 酷文网-论文下载中心 http://www.coolwen.net
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