2结果
2.1 Ad-BDNF的滴度测定 Ad-BDNF的感染滴度经蚀斑形成试验测定，病毒原液扩增、纯化后的感染滴度为8.16×1012pfu/L。
2.2培养SC形态鉴定 在倒置相差显微镜下可见，SD大鼠源性原代SC接种24h后多数细胞已贴壁、伸展；72h后生长良好，形成较多单克隆集落。原代SC经8～10d传代1次。SC的典型形态为长梭状，胞体细长，胞核不明显，胞膜折光性强；细胞间呈复层生长，胞体相互重叠，单克隆集落常呈索带状。S-100染色阳性细胞为SC，其胞体内出现棕黄色着色（以胞质为主,强阳性时胞核也会出现着色），细胞边界清楚，与镜下所见形态一致。
2.3感染后SC中BDNF mRNA的表达 提取感染各组和对照组SC的总RNA，用RT-PCR均扩增出了约430bp的基因片段，与构建的表达单元大小一致，其中cDNA条带灰度以MOI为200组为著，对照组最低。此结果证实，经Ad-BDNF感染的SC有BDNF mRNA的转录表达，且表达量明显高于未感染的SC；MOI为200感染时，人源性BDNF基因转染效率最高（图1）。
0:未感染对照组，1:MOI＝50，2:MOI＝100，3:MOI＝200，4: MOI＝400，M:DNA Marker
图1 不同MOI感染SC后BDNF mRNA的表达
2.4感染后SC无血清培养液上清中BDNF的表达 由于构建的BDNF基因带有BHGpA信号肽序列，因此SC表达的蛋白可以分泌至培养液上清中。经Western Blotting检测， Ad-BDNF感染各组和对照组的SC培养液上清均有13ku的BDNF蛋白条带存在，其中蛋白条带灰度以MOI为200组为著，对照组最低。此结果证实，经Ad-BDNF感染的SC的BDNF表达量明显高于正常培养的SC；MOI为200感染时表达效率最高，这与RT-PCR检测的mRNA结果比较吻合（图2）。
0:未感染对照组，1:MOI＝50，2:MOI＝100，3:MOI＝200，4: MOI＝400
图2 不同MOI感染SC后培养液上清中BDNF的表达
2.5 ELISA检测培养液上清中BDNF的表达 感染的SC在感染3d后BDNF表达量即开始出现升高，6～12d升高趋势明显，15~21d升高趋势减缓，但BDNF表达量能够维持在较高水平，即15, 18, 21d时BDNF表达量无显著性差异(多样本均数间SNK-q检验，P＞0.01)。对照组也表现出随着时间变化，BDNF表达量升高趋势，但在各时间点BDNF表达量均明显低于感染组(配对t检验，P＜0.01，表1)。
3讨论
在研究视神经损伤的早期，学者们普遍认为视神经作为特殊分化的中枢神经在损伤后不可修复和再生，这一观点直到1981年才被Aguayo等[6]推翻，他们发现受损的RGC轴突在含有SC的周围神经桥接物中可以再生。其中SC不仅在视神经损伤处形成细胞索支持和引导再生的神经轴突长入和延伸，还能分泌包括BDNF在内的多种NTF营养受损的RGC[7]。之后的研究又证实BDNF对于视神经损伤修复是较为肯定的。Sawai等[8]采用眼球内注射BDNF可以促进轴突切断后RGC的存活及轴突的再生。Hisanari等[9]将负载有细胞外基质（extracellular matrix, ECM）、体外培养的SC和BDNF的硅胶导管桥接大鼠视神经断端，结果发现其对RGC轴突再生的促进作用明显优于负载任一单因素的硅胶导管。侯旭等[10,11]采用向视神经夹伤后的大鼠玻璃体腔内注射Ad-BDNF的方法发现，其可以转染外源性BDNF基因到RGC中并促进RGC的存活及轴突的再生。但这些方法在临床应用上仍缺乏可行性和安全性，作用比较有限。
我们借助组织工程学和基因转染技术将培养的SC和外源性BDNF基因结合起来，试图将其进一步应用于视神经损伤修复。在转染效率和表达效率的平衡点上我们选择了腺病毒载体，它不仅能够感染包括神经元细胞和胶质细胞在内的多种细胞[12]，而且具有转染效率高，耐受性好，低病源性等优点。结果证实，Ad-BDNF可以有效感染体外培养的SD大鼠源性SC，并介导外源性BDNF基因转染到SC中，而转染有BDNF基因的SC可以高效表达BDNF蛋白。通过以不同MOI感染SC，我们发现制备后感染滴度为8.16×1012pfu/L的Ad-BDNF在MOI为200时转染BDNF基因效率最高。这可能与制备的Ad-BDNF本身性质有关。
在探讨感染的SC分泌BDNF的时效性时，我们发现随着感染后时间的延长，分泌的BDNF在短期内（感染后3d）即呈现出明显的升高趋势，说明腺病毒载体转染的高效性。在10d内（感染后3～12d）很快达到较高浓度后进入维持阶段，维持10d（感染后12～21d）甚至更长时间。这种长效性为将其应用于视神经损伤修复，避免多次反复给药提供了先决条件。与未感染对照组比较，感染组在各个时间点的表达量均明显高于对照组（P＜0.01），分别在感染后12，15，18，21d升高了5.2，5.0，4.7，4.4倍。在维持阶段，感染组的BDNF表达量略有下降，可能与SC生长密度过高、发生接触抑制和少数外源性BDNF基因的衰减、丢失等因素有关。
总之，通过腺病毒介导外源性BDNF基因的转染，可以获得高效、长效表达BDNF蛋白的SC，这将为进一步修复视神经损伤和恢复一定程度的视功能提供前提条件。在含有高浓度BDNF的微环境下，受损的RGC可能更容易存活、轴突更容易再生。转染有BDNF基因的SC能否通过细胞支架材料复合移植的方法应用于视神经损伤后RGC的修复和再生？这些问题还有待下一步实验解决。
【参考文献】
1 Takano M, Horie H, Iijima Y, Dezawa M, Sawada H, Ishikawa Y. Brain-derived neurotrophic factor enhances neurite regeneration from retinal ganglion cells in aged human retina in vitro .Exp Eye Res ,2002;74(2):319-323
2 Akli S, Caillaud C, Vigne E, Stratford-Perricaudet LD, Poenaru L, Perricaudet M, Kahn A, Peschanski MR. Transfer of a foreign gene into the brain using adenovirus vectors. Nat Genet ,1993;3(3):224-228转贴于 酷文网-论文下载中心 http://www.coolwen.net
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