作者：卢春光，胡丹，惠延年
【摘要】 观察腺病毒介导人脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）基因在培养的雪旺细胞（Schwann cell, SC）中的表达，为视神经损伤修复提供可靠的组织工程用的种子细胞。方法：在293细胞中培养扩增BDNF重组腺病毒（adenovirally delivered BDNF, Ad-BDNF），采用蚀斑形成试验测定其感染滴度。体外培养SD大鼠源性的SC，以Ad-BDNF感染培养的SC，用逆转录—聚合酶链反应（reverse transcriptase polymerse chain reaction, RT-PCR）检测BDNF mRNA的表达，用免疫印迹技术（immunoblot assay, Western Blotting）和酶联免疫反应检测（enzyma-linked immumosorbent assay, ELISA）培养液上清中BDNF的表达。结果：Ad-BDNF经扩增后可获得较高感染滴度的重组腺病毒载体。在正常培养条件下未经Ad-BDNF感染的SC低表达BDNF，而感染3d后的SC其BDNF表达明显升高，表达量随时间延长而增加，并能在感染21d后仍维持高表达趋势。结论：Ad-BDNF可以介导BDNF基因转染到培养的SC中，后者可以在较长时间内高效表达BDNF。
【关键词】 视神经损伤
0引言
视神经作为特殊分化的中枢神经，其损伤后局部微环境中的神经营养因子（neurotrophic factor, NTF）在其修复和再生的过程中发挥了重要作用，脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）就是较早被肯定的其中之一[1]。在体内和离体实验中已证实，BDNF可维持、促进外周神经嵴和外胚层基板来源的多种感觉神经元的发育、生长和分化[2]，支持视网膜神经节细胞（retinal ganglial cell, RGC）的体外存活[3]，在治疗神经系统疾病和视神经损伤中有重要意义。雪旺细胞（Schwann cell, SC）的BDNF基础分泌量很有限[4]，采用基因转染技术可使SC具有高效分泌BDNF的能力，再将其通过组织工程学的方法移植到视神经损伤部位，既能维持BDNF的有效作用浓度达到促进视神经修复和再生的目的，又能避免BDNF给药途径上的不便。目前，采用腺病毒载体介导实现BDNF基因在体外培养的SC中表达的研究尚未见报道。我们采用载有人BDNF基因的重组腺病毒（Ad-BDNF）感染SD大鼠源性SC，从mRNA和蛋白分子表达水平检测BDNF基因在SC中的表达情况并探讨其进一步意义。
1材料和方法
1.1材料 所用Ad-BDNF系与中国军事医学科学院基础医学研究所合作研制，本实验室保存，293细胞系本实验室保存。山羊抗S-100多克隆抗体、兔抗BDNF多克隆抗体（Sata Cruz公司），Trizol总RNA提取液和RT-PCR反应试剂盒（Invitrogen公司），BDNF蛋白ELISA检测试剂盒（Promega公司），新生SD乳鼠购自第四军医大学实验动物中心。
1.2方法
1.2.1 Ad-BDNF的扩增及滴度测定 正常培养的293细胞密度达到90%汇合时，加入适量Ad-BDNF液，更换为含50mL/L新生牛血清的DMEM培养液继续培养3~5d，收集出现细胞病变效应（cytopathic effect, CPE）的293细胞，在-80℃和37℃之间反复冻融3次，离心弃沉淀，病毒上清再经CsCl线性密度梯度超速离心纯化后收集分装于-80℃保存备用。Ad-BDNF的感染滴度采用蚀斑形成试验测定。
1.2.2 SD大鼠源性SC的培养 将7日龄SD乳鼠脱颈处死后，剪取双侧坐骨神经用含青霉素、链霉素（均为500kU/L）的PBS溶液浸洗、去除血污。神经组织加入2.5g/L胰蛋白酶、2g/LⅠ型胶原酶混合消化60min后终止，100目筛网过滤，收集滤液， 1 000r/min离心5min，沉淀加入含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液重新悬浮，采用双30min差速黏附法接种细胞，置于37℃，50mL/L CO2条件下培养。接种24h后向培养液中加入10-5mol/L/阿糖胞苷抑制成纤维细胞生长，24h后吸弃，更新培养液继续培养，以后3d更换1次培养液，至细胞融合后以2.5g/L胰蛋白酶消化传代。采用山羊抗S-100多克隆抗体免疫细胞化学进行鉴定。选用第3～4代的细胞用于实验。
1.2.3 Ad-BDNF感染 SC 取密度为5×108/L的SC悬液2mL接种到6孔板孔内，当细胞密度大于80%时，吸弃培养液，根据不同MOI计算所需的病毒量，取相应体积的Ad-BDNF液加入孔内，37℃，50mL/L CO2条件下感染SC，90min后吸弃，更换为正常培养液继续培养。
1.2.4 RT-PCR检测BDNF mRNA的表达 以MOI分别为0（即未感染对照组）, 50, 100, 200, 400的病毒量感染SC，感染后24h将各组SC收集于塑料离心管中，10 000r/min离心10min，加入Trizol液0.1mL使细胞充分裂解后加入氯仿0.02mL抽提，12 000r/min离心15min，吸取上清加入异丙醇0.05mL，室温放置10min后12 000r/min离心10min，沉淀加入750mL/L乙醇清洗混匀后，7 500r/min离心5min，沉淀37℃烘干后溶于DEPC水20μL中，用A 260 /A 280比值鉴定RNA纯度。在Invitrogen公司的ThermoScriptTM RT逆转录酶作用下，以Oligo(dT)20为引物，50℃反应1h，85℃反应30min，将RNA逆转录合成cDNA。取逆转录反应液2μL进行PCR扩增，BDNF cDNA特异性引物序列参照文献设计[5]，上游引物为5’-CACTCTGACCCTGCCCGCCGAG-3’，下游引物为5’-GCATTTAGGTGACACTATAG-3’，产物长度为430bp。反应条件：94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环。取10μL扩增产物行10g/L琼脂糖凝胶电泳检测，条带的光密度由凝胶成像仪分析。
1.2.5 Western Blotting检测培养液上清中BDNF蛋白的表达 以MOI分别为0，50，100，200，400的病毒量感染SC，感染后24h收集培养液上清。上清经低速离心去除分子质量小于3 000u的蛋白，150g/L SDS-PAGE电泳后，蛋白经100V恒压，1h电转移至硝酸纤维素膜上，TBST洗膜后用30g/L BSA/PBS室温封闭2h，兔抗BDNF多克隆抗体（1∶100）4℃孵育过夜，TBST洗膜后用HRP标记的羊抗兔IgG（1∶100）室温孵育3h，TBST洗膜后ECL化学发光法显影，条带的光密度由凝胶成像仪分析。 1.2.6 ELISA检测BDNF蛋白表达的时效性 感染组以MOI为200的病毒量感染的SC，对照组为正常培养的同一代SC，分别在感染后3，6，9，12， 15，18，21d收集培养液上清。收集到的上清保存于-80℃。检测步骤按照Promega公司的BDNF蛋白ELISA检测试剂盒说明书进行。全部数据采用SPSS12.0统计软件进行方差转贴于 酷文网-论文下载中心 http://www.coolwen.net
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