【关键词】 分枝杆菌,结核；Rv2389；基因表达
Construction and expression of eukaryotic expression vector of Mycobacterium tuberculosis Rv2389
【Abstract】AIM: To construct the eukaryotic expression vector encoding Mycobacterium tuberculosis Rv2389 and express it in CHO cells. METHODS: The gene encoding Rv2389 protein were amplified by polymerase chain reaction（PCR）from genome of Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain. After sequenced, Rv2389 gene segments were subcloned into eukaryotic expression vector pCDNA3.1(-). The recombinant plasmid pCDNARv2389 were transfected into CHO cells with liposome. The expressions of mRNA and protein encoded by this gene were detected respectively with RTPCR and indirect immunofluoresent technology. RESULTS: Rv2389 was cloned into pCDNA3.1(-) correctly, and its expression at mRNA and protein levels was detected in CHO cells. CONCLUSION: Recombinant eukaryotic plasmid encoding Rv2389 was constructed successfully. The experiment established the basis for further study on the function of Rv2389.
【Keywords】 mycobacterium tuberculosis; Rv2389; gene expression
【摘要】目的：构建结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达载体. 方法：PCR扩增Rv2389基因，测序正确后克隆入真核表达载体pCDNA3.1(-)，重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染CHO细胞后, 分别以RTPCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达. 结果：构建了重组质粒pCDNA Rv2389， RTPCR结果证明Rv2389可在CHO细胞中转录，间接免疫荧光检测证明，表达有Rv2389蛋白的细胞着染. 结论：成功构建了结核分枝杆菌Rv2389基因的真核表达载体pCDNARv2389，Rv2389基因可以在CHO细胞中表达.
【关键词】 分枝杆菌，结核；Rv2389；基因表达
0引言
结核病是目前危害全球人类健康的重要传染病. 这主要是因为① 卡介苗（BCG）对成年人结核病的预防效果不稳定，保护力为0%~70%；② 没有特异性的诊断试剂；③ 艾滋病等免疫缺陷个体的出现加快了本病的严重后果；④ 耐药菌株的大量出现［1］. 因而寻找更有效的替代卡介苗的疫苗已成为当务之急. Rv2389蛋白是结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB) 复活促进因子（resuscitationpromoting factor, Rpf）样蛋白家族的一员，序列分析发现，它不仅与细菌的增殖有关，还有可能是宿主免疫系统识别的一个靶抗原［2］. 为此，我们在Rv2389原核表达和纯化的基础上，构建了真核表达载体并在CHO( 中国仓鼠卵巢)细胞中进行表达，同时从其表达水平和基因转录两方面进行鉴定，为其功能研究奠定基础.
1材料和方法
1.1材料MTB H37Rv菌株,P815细胞由本室保存；真核表达载体pCDNA3.1(-)由本室保存；含有Rv2389基因的重组质粒pPro EX HTRv2389由本室构建保存；Rv2389蛋白多抗由本实验室制备；AMV，RNA 酶抑制剂和TRIzol（Promega公司）；限制性内切酶、T4 DNA连接酶和核酸分子质量标准品（宝泰克公司）；质粒提取试剂盒（Omega公司）；梭华soft阳离子聚合物（厦门太阳马公司）；羊抗鼠荧光抗体（宝信公司）.
1.2方法
1.2.1Rv2389基因片段的扩增与测序结核分枝杆菌Rv2389全基因序列的特异性引物序列为：P1：5′gga tcc gcc acc atg acc ccg ggt ttg ctt ac3′，含BamHⅠ酶切位点，起始码和cozak序列；P2：5′ccg aag ctt atc gtc cct gct ccc cga tga3′，含HindⅢ酶切位点和终止码. PCR反应条件：94℃ 40 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共30个循环，72℃延伸10 min. 回收PCR产物，用T4连接酶将PCR产物与pGEMTeasy载体连接，转化E.coli DH5α，随机挑取5个克隆提取质粒进行双酶切鉴定，取2个鉴定正确的克隆进行测序［3］.
1.2.2重组质粒的构建及鉴定将测序正确的Rv2389基因克隆至真核表达载体pCDNA3.1(-)，构建重组质粒pCDNARv2389. 连接转化、质粒提取均按文献进行［3］. 以BamHⅠ和HindⅢ酶切pCDNARv2389，10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒.
1.2.3细胞转染将5×105 个CHO细胞接种于6孔板，细胞数量达孔底约2/3时进行转染. 转染前用不含抗生素的1640培养液洗2次，以0.5 mL 1640培养液重悬细胞. pCDNARv2389重组质粒10 μL和阳离子聚合物5 μL各用80 μL无血清的1640培养液稀释，两者混匀后室温作用20 min，缓慢加入到细胞中. 培养24 h后收集细胞，同时设正常细胞对照.
1.2.4RTPCR检测mRNA表达收集重组质粒转染的CHO细胞，2000 r/min离心10 min. 参照Gibco的TRIzol试剂盒说明书提取细胞mRNA. 在上述10 μL mRNA 溶液中，加入1 μL Oligo(dT)12-18引物，70℃水浴5 min后立即置于冰上，加10×buffer 4 μL， MgSO4 4 μL， 10 mmol/L dNTPs 2 μL，RNA inhibitor 0.6 μL，AMV 0.8 μL，H2O 10.4 μL. 混匀，42℃作用1 h，70℃ 15 min终止反应. PCR反应时加入cDNA第1链2 μL，反应条件为94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸40 s，共进行30个循环，末次循环72℃延伸2 min，扩增产物以10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测.
1.2.5间接免疫荧光检测目的基因表达将转染pCDNARv2389质粒的CHO细胞爬片，用纯化的Rv2389融合蛋白制备的免疫血清作为一抗，间接免疫荧光法检测CHO细胞中融合蛋白的表达［4］. 2结果
2.1目的基因的扩增、克隆及酶切鉴定用PCR方法从H37Rv中扩增出Rv2389的DNA片段，被顺利克隆入pGEMTeasy载体，测序证实所克隆的基因完全正确. 序列分析转贴于 酷文网-论文下载中心 http://www.coolwen.net
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