    1.4 APC基因的不对称PCR扩增 APC基因上游引物5’-GGGGTTAGGGTTAGGTAGG-3’，下游引物5’-AACTACACCAATACAACCACATA-3’。PCR反应体系：反应体积25μl，包括10×PCR buffer(有MgCl2) 2.5μl，10mmol/L Cy3-dNTP 2μl，10mmol/L上游引物0.5μl，10mmol/L下游引物2.5μl，模板DNA 1μl，5u/μl Taq酶 0.2μl，灭菌双蒸水18.5μl。PCR扩增条件：95℃ 3min预变性，94℃ 30s变性，57℃ 30s退火，72℃ 40s延伸，40个循环，72℃延伸8min，4℃保存。

    1.5 基因芯片的制备在洁净的载玻片上，用2ml 1.2%的琼脂糖溶液均匀的平铺在玻片表面，待其凝固后置于37℃烘干。使用前将其浸泡于0.1mol／L的NaIO4溶液中30min，再用蒸馏水洗片3次，每次5min，晾干后备用。在APC基因启动子区甲基化位点较多的区域设计了16个CpG位点(分布于5个探针)和一个阴性对照，6个探针点样于膜片上。探针固定后备用。

    1.6 芯片杂交在各管中加入15μl的转化产物和15μl的杂交缓冲液，置于95℃水浴锅变性7min。将变性好的杂交液滴于玻片上的点样区，并用18mm×18mm盖玻片盖于其上，然后避光置于37℃杂交2h，分别用2×SSC+0.2% SDS液、0.1% SSC+0.2% SDS液、0.1% SSC液洗涤共10min，室温晾干后用ScanArray 5000 扫描仪扫描。

    1.7 芯片扫描和结果判定对芯片扫描得到Cy3 图像文件通过圈点确定杂交范围，过滤背景噪声，提取基因表达的荧光信号强度值，用预先定的内参照基因(植物基因) 对Cy3 的原始提取信号进行均衡和修正；用stroppro2.0 软件分析Cy3 荧光信号的强度和比值。用以下3 个条件作为判定基因阳性表达的标准: (1)Cy3 阳性点的荧光信号平均值超过阴性点信号的3倍，ratio 比值范围在2.7～3.3； (2) 阴性荧光信号值<600，Cy3 阳性荧光信号值减去阴性荧光信号值后>400；(3)PCR结果良好。

    1.8 统计学处理以上杂交过程均重复3次，数据取3次试验结果的平均值，数据以均值±标准差 (x±s )表示。用统计学处理采用SPSS11.5分析软件进行方差分析和SNK法进行统计分析比较。统计检验的显著性设在P<0.05。
    2 结果

    2.1 血浆DNA的亚硫酸氢钠转化提取出的血浆DNA经亚硫酸氢钠预处理后，非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶，随后进行PCR扩增，此过程进一步将模板上的尿嘧啶转化为胸腺嘧啶；而甲基化的胞嘧啶不受影响，保持不变。根据所选引物，APC的扩增片段为178bp，见图1。

                           1:健康 2：产后 3、4:早期

                        5、6:中期 7、8:晚期 M：marker

                          图1 亚硫酸氢钠转化后APC基因

                             扩增产物的琼脂糖电泳结果

    2.2 基因芯片的杂交结果

    2.2.1 中期妊娠和健康未孕样品中APC启动子区甲基化模式比较图2中2与5显示其芯片扫描结果，由图中可见，在妊娠中期c、d探针上杂交点的信号相对较强，在未孕妇女样本中荧光强度值较弱，杂交扫描后s-median 532值组间方差分析表明差异有显著性(P<0.05)，说明 APC基因在健康妇女血浆中是低甲基化或未甲基化的，而在妊娠状态下是高甲基化的。从而表明妊娠对血浆DNA甲基化程度有着较多的影响，妊娠妇女与健康未孕妇女的甲基化状态有比较明显的差异。DNA甲基化作为一种新的产前诊断的标志物可以应用于产前诊断，为无创性产前诊断的发展打下了基础。

     图中a、b、c、d、e、f分别表示APC启动区不同CpG位点AP1、AP2、AP3、AP4、AP5的杂交结果，

        1、2、3、4、5代表妊娠的早期、中期、晚期、产后1周、健康未孕五种妊娠状态。

                        图2 妊娠各时期芯片杂交结果

                  子区不同CpG位点荧光信号图谱及分析

    2.2.2 不同妊娠时期及未孕样品中APC启动子区甲基化模式比较笔者进一步对不同妊娠时期APC甲基化变化情况进行了比较，见图2妊娠各时期芯片杂交结果及图3妊娠各期与健康未孕妇女APC启动子区不同CpG位点荧光信号图谱及分析。妊娠中期和晚期样品检测结果中APC基因的甲基化状态有相似的模式，而在妊娠早期有较大的差异，杂交扫描后s-median 532值SNK分析表明早、中、晚妊娠期b探针上差异有显著性(转贴于酷文网-论文下载中心 http://www.coolwen.net

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