生物技术在中药现代化中的应用

　　2.2  DNA遗传标记、电泳技术DNA作为生物群体细胞中的遗传物质，具有遗传稳定性，代表了该种群的基本遗传特征，对其标记，制定出其正品的标准DNA指纹图谱，为鉴别不同类别中药提供了方便快捷的方法。主要有扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP），限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP) ，随机扩增多态性(Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD) ，微卫星DNA，任意引物PCR等。RAPD简便、快速，应用最广，已鉴定了木蓝属8种生药、铁线莲属7种生药和西红花［8］等。用RFLP技术鉴定了羽扇豆属药用植物的亲缘关系与所含生物碱类成分的相关性。PCR直接测序技术用于鉴定人参、鸡内金、鹿鞭等。高效毛细管电泳法(High Performance Capillary Electrophoresis, HPCE)是近几十年飞速发展起来的新的分析技术，它根据离子在缓冲液中迁移的速度与电场呈正比原理,将凝胶电泳解析度和快速液相色谱技术溶为一体，展示出特有的分离能力与极大的应用前景。如用于测定茶碱血浆浓度［9］,测定中药、中成药的有效成分含量［10］。

　　2.3  分子免疫技术疾病发生时异常基因功能的实现最终还依赖于蛋白质表达,中医药预防和治疗疾病的疗效最终也往往落实到蛋白质,通过对有关蛋白质的调控而发挥作用［11~12］，因此,观察蛋白质水平的变化是中医药作用机制研究的重要环节。分子免疫技术检测的原理是应用已知特定的抗体(抗原)对标本中相应的抗原(抗体)蛋白进行定性或定量的检测。应用于中药材，鉴别其真伪，特异性强。目前主要包括免疫印迹法、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫酶技术、免疫-聚合酶链式反应技术等［13］。

　　2.4  转基因技术国外获得成功的转基因药用植物有8种，其中转基因烟草可以生产人用溶酶体酶及多种人与动物疾病抗体，转基因玉米生产重组霍乱疫苗、单克隆抗体等。药用植物基因工程起步较晚，但也有一些可喜成果，方法主要有农杆菌介导的基因转移、种质系统的基因转移和外源基因直接导入法。以Arntzen研究小组为代表的多个研究组相继在烟草、马铃薯、苜蓿等植物中成功表达了乙肝病毒表面抗原、大肠杆菌毒素B亚基、霍乱毒素B亚基、诺瓦克病毒衣壳蛋白等［14］。戴均贵等［15］用长春花悬浮培养细胞实现了对天麻素的生物转化。转基因技术广泛地用于优化种质，保护和繁殖珍稀濒危动、植物品种，保证中药资源的可持续发展。提高表达效率，大规模生产仍是目前研究的难点。

　　2.5  基因芯片技术基因芯片技术可显示出中药作用的所有靶基因。药物处理后基因表达的改变对研究药物作用机制有一定的提示作用。此技术可以分析单味中药或中药复方用药前后机体的不同组织、器官基因表达的差异，从而发现一组病症相关基因和药物效应基因，作为药物筛选靶标，优化靶点，开发新药。同时可对中药中的各种成分进行平行筛选，比较各种成分作用后机体基因表达的差异，结合体内组织学和生物化学的改变，探索中药的有效成分及存在状况，寻找有效部位和制备单体。现在北京、上海的两个国家级药物筛选中心均已采用此技术对中药提取物和天然化学成分进行筛选，浙江江南生物科技有限公司已经研制出中药鉴定和筛选的基因芯片。王军等［16］用此探讨局灶硬化性肾小球肾炎模型小鼠的细胞因子表达谱，以及复方积雪草对其细胞因子网络的表达调控作用。余榕捷等［17］利用基因芯片研究六味地黄丸对老年大鼠基因表达的影响。吴伟康等［18］应用基因表达谱芯片观察小鼠心肌缺血后基因表达的变化以及四逆汤对其的影响。Wachs等［19］发明了一种微型化的离子喷雾装置，适合于与基于芯片的分离装置、多孔或带有待测样品残渣的表面联用，帮助人们对芯片分离所得样品或多孔板中样品进行质谱检测。

　　2.6  植物细胞工程实施药用植物的细胞工程，可以利用生物反应器对植物细胞组织大规模培养，通过一系列的单元操作和有效的细胞程序调控，提高中药有效成分含量，通过对有效成分含量的标准化，可提供与天然中药材具有相同药理作用的中药原料产品。其次，还可运用植物细胞工程技术分离和提取中药有效成分，解决原料(栽培)质控、安全性和有效性等问题，使中药产品的技术含量高，质量可控， 疗效确切， 易于制备各种现代制剂。植物细胞工程有助于实现中药生产标准化，实现濒危珍稀中药材和具有较高临床价值的现代中药产品的二次开发。目前，已从400多种药用植物中建立了组织和细胞培养物，分离出600多种代谢产物。我国许多药用植物如人参、丹参、甘草、黄连等的细胞培养都获得了成功，人参、新疆紫草细胞培养技术接近国际先进水平，已经工业化和商品化。姜海英［20］报道，人参通过组培生长25 d后，人参皂苷含量高达3.5％～6.0％ ，药效相当于6龄参。中科院生化过程工程研究所成功培养了紫杉醇、紫草宁、麻黄碱、雪莲、藏红花等10余种药用植物及代谢产物，还在微型薯、青蒿发根转化苗反应器培养方面获得了成功［21］。美国Phyto公司已达到75 000 L紫杉醇的生产规模。此外，毛状根和不定根组织培养也很成功，培养的黄芪毛状根的效价与药用黄芪类似，丹参毛状根的培养物含有7种丹参碱。并能分泌到培养基中。希腊毛地黄细胞在褐藻酸盐的固定化下培养，可将有毒物质毛地黄苷转化为地高辛，利用紫草细胞培养技术生产紫草宁等［22］。依据野生新疆雪莲的抗炎、抗辐射等作用，有人［23］进行了细胞培养物与天然新疆雪莲抗炎、镇痛和抗辐射的药理实验，表明新疆雪莲细胞培养物可以成为野生新疆雪莲的替代品，具有深入开发应用的价值。　2.7  发酵工程中药发酵研究始于20世纪80年代，人工条件下利用细胞的快速增殖与次生代谢产物的产生，为人工资源的生产提供技术平台。水蛭素不与血小板反应,在治疗血小板减少症（HIT）方面具有其它抗凝药物无法比拟的效果。在5L发酵罐中重组毕赤酵母能够高密度发酵产生水蛭素,最高总产量1.8 g/L, 为大规模工业化铺平了道路［24］。周晓燕等［25］用经选育的猪芩PU-99菌作生产菌株，在1t罐中生产，菌丝体干重2.3％，含粗多糖31％。利用微生物生长代谢来炮制中药，比一般的物理或化学炮制手段优越，可较大幅度地改变药性，提高疗效，降低毒副作用，为中药活性成分结构修饰提供新途径，产生新药效，扩大适应症，保护中药活性成分免遭破坏，节省药源。转贴于 酷文网-论文下载中心 http://www.coolwen.net