差异基因表达分析法在胃癌中的应用

    读片程序的编辑：用加有5个多肽标准品的芯片校正质谱仪的分子量。

    数据的读取：在Ciphergen ProteinChip软件中以设定的读片程序读取芯片。结合EAM后的蛋白质在激光的脉冲下从芯片表面解离，在电场作用下，不同大小的蛋白质以不同的飞行速度在真空管中飞行的时间不同，从而得出精确的分子量（M/Z）和电子流量。本实验应用激光强度185，灵敏度7。

    数据处理及统计学分析：用Ciphergen ProteinChip软件和Biomarker Wizard软件对芯片检测得到的蛋白质相对含量及蛋白质质荷比数据按数据要求进行处理。Biomarker Wizard软件用方差分析计算不同组相同质荷比的蛋白质含量的P值。用数据挖掘软件Biomarker Pattern(其采用的是决策树方法对目标对象进行分类)对数据分组及相关性进行分析。

    盲法分析方法：用建立的蛋白质谱模型对36例未知的血清标本（包括胃腺癌患者、胃炎患者与健康人）进行盲法预测，验证模型。

    2 结 果

    2.1 胃腺癌组与正常人组比较

    分别对64例样本检测质谱图进行分析比较，共得到蛋白质峰为45个，其中5910Da、5084Da、8691Da这三个蛋白质峰差异有统计学意义。其中在5910Da峰处胃腺癌的患者，均比正常人高，5084Da峰处在胃腺癌患者中均在该峰旁边出现二联峰或三联峰，峰的高低与肿瘤的分化恶性程度正相关；在这3个峰中只有8691Da峰的值为肿瘤患者低于正常人（见图1、表1）。33例胃腺癌的样品中，有30例被准确检出为胃腺癌 ，31例健康志愿者中有29例确定为非胃腺癌。结果表明，该方法的灵敏度为90.91%(30/33)，特异性为93.55%(29/31)，阳性预测值为93.75(30/32)。这三个蛋白质峰数据建立蛋白质谱模型，用25例样本进行盲法测试，15例胃腺癌中14例被准确检出，10例健康志愿者全部被准确检出。其敏感性为93.3%（14/15），特异性为100%（10/10）。

    2.2 胃腺癌组与胃炎组比较

    分别对63例样本检测质谱图进行分析比较，共得到蛋白质峰为38个，其中5910Da、6440Da这两个蛋白质峰差异有统计学意义。其中在5910Da峰处胃腺癌的患者，均比胃炎高，6440Da峰处胃腺癌的患者均比正胃炎低（图2），5084Da峰处在胃腺癌和胃炎患者中均在该峰旁边出现二联峰或三联峰，可见该峰可能与胃损伤有关。利用这两个蛋白质峰数据建立蛋白质谱模型，用26例样本进行盲法测试，15例胃腺癌中14例被准确检出，11例胃炎患者中有10例被准确检出。其敏感性为93.3%（14/15），特异性为90.9%（10/11）。

    3 讨 论

    蛋白质组学研究是与癌发生学相对应的一个领域，任何肿瘤的发生在出现病理变化之前，细胞内的蛋白质在成分和数量上都会有相应的改变，所以在理论上，通过对蛋白质的动态观察可以筛选出疾病早期的指标。目前，蛋白质组学研究的主要技术是双向电泳和质谱等。虽然双向电泳的技术很成熟，但它复杂的实验过程和大量的标本需求不适应大规模的标本检测，限制了双向电泳直接用于临床检测。而对SELDI技术而言，其表面可结合特定的蛋白质，可以直接检测相对原始的生物样品，并可同时进行多样品、多蛋白的检测，从而提供了适合于蛋白质的研究[1~6]。目前用SELDI蛋白芯片技术获得有意义成果的数量已经日益凸现，尤其在一些肿瘤诊断上，如前列腺癌[7]、卵巢癌[8]、乳腺癌[9]等的诊断。

    胃癌具有起病隐匿，早期常因无明显症状而漏诊，易转移与复发，预后差等特点。目前，已有的肿瘤标志物单项指标的灵敏度仅为18%~40%，联合应用的结果虽然可达60%~80%，但假阳性率较高，难以作为早期诊断的指标。所以，利用SELDI技术检测胃腺癌，可以准确地将其分辨出来，并在质谱图中可以清楚显示差别，说明该方法对胃腺癌的诊断具有重要的意义，并可作为临床观察疗效的指标之一。 本实验选用33例手术后病理检查确诊为胃腺癌患者的术前抽检标本和31例健康志愿者及30例活动性胃炎患者的血清标本，采用美国CiphergenBiosystems公司生产的表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱仪（SELDI?鄄TOF?鄄MS）选用 SAX2（强阴离子交换芯片）。在胃腺癌与胃炎患者中发现质/荷比为5910Da、6440Da处两个峰的同时变化，具有明确的诊断意义。其中在5910Da的蛋白质较正常人表达明显升高，而6440Da处则低表达。特别是在5084Da峰旁边出现的二联峰或三联峰，出现在胃腺癌和胃炎病人中，说明5084Da峰的存在可能是显示患者存在胃损伤的表现。而在胃腺癌与健康者组中发现5910Da、5084 Da、8691 Da这三个蛋白质峰差异有统计学意义。其中在5910Da峰处胃腺癌的患者均比正常人高，5084Da峰处胃腺癌患者中均在该峰旁边出现二联峰或三联峰，其峰的高低与肿瘤的分化恶性程度正相关，从而提示该蛋白质可能存在的羟基化转录后修饰在胃腺癌发生发展中的地位。在这三个峰中只有8691Da峰的值为肿瘤患者低于正常人。通过5910Da、5084 Da、8691 Da和6440 Da四个蛋白质峰建立区分胃腺癌与非胃腺癌的血清蛋白表达质谱诊断模型，为胃腺癌的临床诊断提供了一条崭新的途径和方法。通过这几个峰的鉴别，其结果明显高于常规肿瘤标志物的联合检测。

    综上所述，运用该种技术，能够采用较少量血清对高危人群进行筛查，及早发现胃腺癌患者，并且可通过进一步研究以明确其临床意义。该实验的发现可为临床胃腺癌的血清学诊断及进一步的胃腺癌早期诊断提供良好前景。

【参考文献】
  [1]何大澄，肖雪媛.SELDI蛋白质芯片技术在蛋白质组学中的应用[J]. 现代仪器, 2002(1):1.

[2]Shevchenko A, Wilm M, Mann M.J Protein Chem,1977,16(5):481.

[3]Weinberger SR,Boschetti E,Santambien P, et al. Surface enhanced laser desorption?鄄ionization retentatechromatography mass spectrometry(SELDI?鄄RC?鄄MS);a new method for rapid development of process chromatography conditions[J].J Chromatogr B Analyt Technol BiomedLife Sci,2002,782:307-316.转贴于 酷文网-论文下载中心 http://www.coolwen.net