差异基因表达分析法在胃癌中的应用

【摘要】  　　［目的］探讨用蛋白质芯片技术筛选胃腺癌患者血清蛋白质表达谱,寻找血清中的标志性蛋白。［方法］采用蛋白质生物芯片表面增强激光解析电离飞行时间质谱（SELDI）技术,运用SAX2 (Strong Anionic Exchanger)蛋白质芯片检测胃腺癌患者、胃炎患者和健康者血清,建立诊断模型,然后进行单盲模型验证。［结果］发现5910Da、5084Da和8691Da的三个蛋白质荷比峰(M/Z)在胃腺癌和健康组比较中具有显著性差异。5910Da、6440Da的两个蛋白质荷比峰(M/Z)在胃腺癌和胃炎组中比较具有显著性差异。［结论］建立了胃腺癌的血清蛋白指纹质谱，为以后的胃癌蛋白质组学研究奠定了一定的基础，建立了以5910Da、5084Da、8691Da和6440Da四个蛋白质峰为模型区分胃腺癌与非胃腺癌的血清蛋白表达质谱诊断模型，为胃腺癌的临床诊断提供了一条崭新的途径和方法。

【关键词】  表面增强激光解析电离-飞行时间质谱　蛋白质芯片　生物标记　胃腺癌

　　Application of Serum Proteomic Patterns for Detection of Gastric Adenocarcinoma

        serum protein profiling ofastricadenocarcinoma by surface-enhancedlaser desorption/ionization time of flight mass spectrometry(SELDI-TOF-MS) to discovering the discriminalory proteins.［Methods］The diagnosis model was established by SELDI technique with SAX2 chip to detect the serum of patients with gastric adenocarcinoma, gastricism and healthy persons, and tested by single-blind model.［Results］Three specific protein fingerprint biomarkers massed at 5910, 5084, 8691 between gastric adenocarcinoma group and control group with statistical significance. Two specific protein fingerprint biomarkers massed at 5910, 6440 between gastric adenocarcinoma group and gastricism group with statistical significance.［Conclusions］ A gastric adenocarcinoma protein fingerprint and a foundation for later study of gastric cancer proteomics is developed. The diagnostic model of the protein profiling(5910Da, 5084Da, 8691Da, 6440Da) for distinguishing gastric adenocarcinoma from non-gastric adenocarcinoma is established to aid a new approach in clinical diagnosis for gastric adenocarcinoma.

      2.Institute of Cell Biology, Zhejiang University, Hangzhou 310031,China)Abstract: ［Purpose］ Toscreen out

    胃腺癌是常见的癌肿之一，占全部恶性肿瘤的第三位，占消化道恶性肿瘤之首,而且近年来发病有明显年轻化趋势。相当多的胃腺癌患者发现时已经是晚期，我国每年死于胃腺癌约16万人。目前已有的肿瘤标志物单项指标检测胃腺癌的灵敏度仅为18%~40%，联合应用的结果虽然可达60%~80%，但假阳性率较高，难以用于早期诊断。因此，寻求早期诊断胃腺癌的特异方法是目前临床亟待解决的难题。我们利用表面加强激光解吸离子化飞行时间质谱（surface?鄄enhanced laser desorption and ionisation，SELDI）技术，对胃腺癌患者与正常人和胃炎患者血清中的蛋白质进行对比分析，筛选可用于临床胃腺癌早期诊断的特异性生物标记物。

    1 材料与方法

    1.1 血清样品

    所有病人血清样品均为2003年8月~2004年6月台州市立医院手术后病理检查确诊为胃腺癌患者的术前抽检标本，对照样品来自经健康查体正常的健康志愿者及经病理检查为活动性胃炎患者的血清。全血采集在10ml血清分离管中，4 000r/min离心10min。取30μl血清分装在0.5ml离心管中，于-80℃冰箱保存。33例胃腺癌,其中男性22例，女性11例，平均年龄56.5岁(45~71岁)；31例健康志愿者其中男性20例，女性11例，平均年龄63岁(43~70岁)，30例胃炎患者其中男性20例，女性10例，平均年龄58.9岁(46~70岁)。另盲法试验组36例（15例胃腺癌、10例健康志愿者、11例胃炎患者）。

    1.2 仪器和试剂

    美国赛弗吉公司(Ciphergen Biosystems, Inc.)生产的表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱仪(Surface Enhanced Laser Desorption Ionization?鄄time OF Flight?鄄Mass Spectrometry, SELDI?鄄TOF?鄄MS)及该公司配套的蛋白质芯片SAX2 (Strong Anionic Exchanger,强阴离子交换) 芯片。

    主要试剂：尿素、乙腈、三氟乙酸等均购自Sigma公司，SPA(Sinapinic Acid)购自CiphergenBiosystems公司。U9缓冲液(9M Urea, 2% CHAPS,1%DTT)，U1缓冲液(用50mM Tris?鄄HCl缓冲液，9倍稀释U9缓冲液)，SAX2缓冲液(100mM Tris?鄄HCl pH9.0)。

    1.3 方 法

    血清样品准备：融解冰冻血清并于4℃离心20 000转，10min。每个样品取20μl血清，分别置于1.5ml离心管中。加30μlU9缓冲液于每一试管，于4℃振摇20min，每管加入100μlU1缓冲液，盖严并于4℃震荡30min。

    芯片平衡：在芯片每个芯池中加入150μl相应的结合/洗脱缓冲液，置于振荡器上，室温孵育5min后除去缓冲液，重复上述操作1次。

    芯片与蛋白质结合反应：从上述蛋白变性后的血清样品中取50μl样品，加入200μl相应的结合/洗脱缓冲液，使最后上样的样品总共稀释约40倍，置于振荡器上，室温孵育60min后除去样品。

    芯片冲洗：每孔中加入150μl相应的结合/洗脱缓冲液，置于振荡器上室温孵育5min，除去缓冲液，重复上述操作2次，最后芯片用相应pH的1mM HEPES淋洗。去除水后，晾干芯片。  加能量吸收分子（energy absorbing Molecule，EAM）：取出芯片，在Sinapinic Acid中加入200μl乙氰，200μl 1％TFA，充分振荡5min使溶解，离心1min；每孔分2次加Sinapinic Acid（0.5μl/次），两次之间允许各孔风干。