人CD14转基因细胞系的建立

　　细胞培养

　　小鼠黑色素瘤细胞B16用含10％小牛血清、100  μg/m l 链霉素、100 U/m l 青霉素的RPMI  1640培养液，在5％ CO 2 浓度、饱和湿度及37℃培养条件下培养。　重组质粒转染B16细胞及G418抗性克隆的筛选

　　用RPMI 1640培养液 (含小牛血清与双抗) 将细胞悬液配成1×105/ml浓度，以2 ml/well于6孔板，24 小时后，将纯化的质粒pcDNA 3.1 (+ ) 和pcDNA 3.1(+ )/CD14，用Superfect tran sfection reagent并按其操作说明转染B16细胞。24小时后换液，加G418进行筛选，每孔浓度为800 μg/ml。转染第12天，对6孔板上存活的细胞继续培养，G418浓度为800 μg/ml，待明显的克隆长出来后，将单个克隆挑到24孔板扩大培养，G418浓度为800 μg/ml。

　　CD14强阳性细胞系B16/CD14的初步筛选

　　用消化液将24孔板的细胞消化后，PBS洗涤2次，按照1×105细胞/管加入流式细胞仪专用管，并加入2.5 μl标准CD14-PE和2F9-FITC，阴性对照及未转染的B16细胞组分别加入γ1-PE 、CD14-PE、γ1-FITC和2F9FITC，4℃反应30分钟，PBS充分洗涤，用FACSCabliburTM流式细胞仪和CellQuest软件获取并分析10 000个细胞。
         

          结    果

　　CD14 cDNA的扩增

　　RT-PCR产物琼脂糖电泳结果显示扩增到1128 bp大小的目的基因片段（图1），EcoRI酶切白色菌落抽提的质粒，10个克隆有9个克隆中有约1 200  bp的目的片段（图2）。将其中1个EcoRI酶切阳性的质粒pGEM○R-T Easy /CD14纯化测序。结果表明，扩增到的CD14基因与GenBank中的人CD14 cDNA序列完全一致。

　　重组质粒pcDNA3.1（＋）/CD14的鉴定

　　pcDNA3.1（＋）/CD14经HindⅢ和XbaⅠ双酶切后，琼脂糖凝胶电泳可见1 128 bp的CD14基因片段（图3）。Figure 3.Restriction analysis of pcDNA3.1(+)/CD14 with Hind Ⅲ and XbaⅠ.

　　转染后B16细胞的G418筛选

　　B16细胞转染pcDNA3.1（＋）/CD14和pcDNA3.1（＋）后，经G418加压筛选，未转染的B16细胞在含G418的RPMI  1640培养液中，第10天全部离壁死亡，第12天转染组细胞绝大部分死亡，但可见散在生长的G418抗性细胞克隆。

　　CD14阳性B16/CD14细胞的筛选

　　应用标准的鼠抗人CD14直标单克隆抗体CD14-PE和自行研制的鼠抗人CD14直标单克隆抗体2F9-FITC，通过流式细胞术检测到2株CD14部分阳性表达的B16/CD14细胞系，CD14阳性细胞百分数和平均荧光强度（MFI）分别见图4。

　　讨 论

　　M5是急性髓系白血病（AML）中的常见类型，可分为未分化型(M5a)和部分化型(M5b)两种类型，它们恶性程度高，对化疗反应较差，长期预后不良。大量研究表明，M5细胞表面具有大量内毒素脂多糖(LPS)受体CD14分子表达，且该分子特异性好、敏感性高，用抗人CD14单克隆抗体能识别结合该抗原分子，它是诊断M5的重要标志［5，6］。CD14不仅是LPS和LPS/LBP复合物的受体，更是髓系单核/巨噬细胞分化的特异性表面标志抗原，主要在正常单核细胞和巨噬细胞上表达以及在单核细胞相关性白血病细胞上大量表达，在其它细胞系统上不表达，在正常粒细胞上仅微弱表达或不表达［1］，且单核细胞能通过CD14将与CD14抗原分子结合的分子内吞入细胞内［2］，这为CD14作为靶向治疗M5等单核细胞相关性疾病提供了有利条件。为了建立人M5白血病的动物模型以便能更好地进行M5白血病的体外及体内导向治疗研究，我们通过脂质体转染法，利用B16细胞的高效转染性，建立了两株人CD14抗原阳性表达的鼠细胞系B16/CD14。

    人类编码CD14的基因已经被克隆和测序。该基因位于5q31.1，其基因组DNA约含1 338个核苷酸残基。从第76位核苷酸到第1 200位，编码一段375个氨基酸残基的多肽链［7］，它由2个外显子编码，其中第1个外显子只含1个起始密码子ATG，紧接着是1个含88个核苷酸残基的内含子［8］。为了避免基因组DNA的污染，我们对单核细胞抽提的总RNA采用无RNA酶的DNA酶进行消化，保证了PCR模板是来自CD14的cDNA，而不是其基因组DNA。此外，由于CD14基因的编码区超过1 kb，为了确保PCR过程中Taq酶的忠实性，我们采用高保真Taq酶。测序结果和互联网数据核实情况表明，我们所扩增的1 128 bp的人CD14基因序列是完全正确的。

    B16细胞是来源于小鼠黑色素瘤的细胞株，本身不表达CD14分子，且其对pcDNA3.1等多种质粒具有高效转染性［9］。G418对哺乳动物细胞具有高度的毒性，在400 μg/ml的浓度下大部分的真核细胞即不能存活。只有转染了含G418抗性基因的重组质粒并表达的B16细胞才可以存活生长。我们对有G418抗性的24个克隆进行扩大培养，每个克隆收集1×105细胞，采用国际标准直标单克隆抗体CD14-PE和自行研制的鼠抗人CD14直标单克隆抗体2F9-FITC［10］，通过流式细胞术检测发现2个克隆的部分转染细胞表达CD14，CD14-PE检测的阳性细胞百分数分别为25.28％和36.59％，2F9-FITC检测结果分别为 25.59%和36.32%％，而未转染和转染pcDNA3.1（＋）的B16细胞两种单克隆抗体检测结果均为阴性。这些结果说明人CD14抗原在B16细胞膜上成功地得到表达，但是由于挑选贴壁细胞集落时不能做到1个集落来自于1个细胞，或者集落培养的过程中部分G418抗性的细胞发生目的基因的丢失，使这两个集落有些G418抗性细胞不表达或低表达CD14分子。

    本研究中，我们建立了2株人CD14阳性表达的细胞系B16/CD14，并拟用G418选择培养基亚克隆后获得均一的、高纯度的、人CD14强阳性的细胞株。人CD14抗原阳性表达的鼠细胞株B16/CD14的建立必将为人M5白血病动物模型的建立及其导向治疗研究奠定坚实的基础。转贴于 酷文网-论文下载中心 http://www.coolwen.net