人CD14转基因细胞系的建立

  作者：宁铂涛，汤永民，徐妍，陈燕飞，曹江

【摘要】  本研究构建人CD14真核表达质粒，建立转基因CD14阳性细胞系，为建立急性单核细胞白血病（M5）导向治疗动物模型提供研究材料。 从正常人外周血单个核细胞抽提总RNA，以无RNA酶的DNA酶处理，RT-PCR扩增CD14基因，T-A克隆测序并与GenBank中人CD14的基因序列比较核实。通过双酶切和体外连接法将目的基因克隆至表达载体pcDNA 3.1 (+ )； 用Superfect transfection reagent 将重组质粒pcDNA 3.1（＋）/CD14 转染到C57BL/6小鼠黑色素瘤细胞B16，经G418 筛选，用流式细胞术检测CD14蛋白的表达情况，初步筛选出CD14阳性的细胞系B16/CD14。结果表明：测序及GenBank中序列比较结果显示扩增到的人CD14基因序列是正确的，酶切结果表明表达质粒构建正确。流式细胞术筛选到2个CD14阳性表达的细胞系B16/CD14（标准CD14-PE阳性细胞百分数分别为25.28％、36.59％，2F9-FITC为25.59%、36.32%）。结论： 建立了人CD14抗原阳性表达的鼠细胞系B16/CD14，为人M5动物模型的建立及其导向治疗的研究奠定了坚实的基础。

【关键词】  转基因细胞系

　　Establishment of  Murine Cell Line Transfected with Human CD14 Gene

　　Abstract This study was aimed to construct the CD14 eukaryotic expression vector，establish the transgeneic CD14 positive cell line in order to facilitate the establishment of a mouse model of antibody targeting therapy for human acute monocytic leukemia (AML-M5). Total RNA extracted from peripheral blood mononuclear cells was treated with RNAase-free DNAase，the human CD14 gene was cloned and sequenced through the RT-PCR and T-A clone techniques.Eukaryotic expressional vector pcDNA3.1(+)/CD14 was constructed by cleaving with double restriction endonuleases and ligating with T4 ligase.A murine melanoma cell line B16 was transfected with the pcDNA3.1(+)/CD14 recombinant with Superfect transfection reagent.Positive clones were selected by G418 and the expression of human CD14 on the transfectant was confirmed by flow cytometry (FCM).The results indicated that the sequence of the human CD14 cDNA cloned was exact  to  be same as the one from GenBank database.The recombinant pcDNA3.1(+)/CD14 was identified with double-enzyme  cleaving.The expression of the human CD14 on the transfectant (B16/CD14) was confirmed by FCM.In conclusion，the  murine cell line B16/CD14 fransfected with human CD14 gene   has been  established which can be used for the study of human AML-M5 antibody targeting therapy  with mouse model.

　　Key words  CD14；transgeneic  cell line；acute monocytic leukemia; mouse model

    急性单核细胞白血病（AML-M5）是难治性白血病之一，CD14是M5细胞膜上的特异性标志，它在其它细胞成分包括T、B、自然杀伤细胞(NK)、红细胞、血小板、造血干/祖细胞以及非造血系统细胞上不表达［1］，并且单核细胞能通过CD14将与CD14抗原分子结合的分子内吞入细胞内［2］，因此CD14是导向治疗AML-M5的良好靶点。本研究组已经将自制鼠源性抗人CD14单克隆抗体（ZCH-7-2F9）研制成基因工程抗体，拟进一步进行动物试验。为了建立良好的动物模型，一个稳定表达人CD14抗原分子的肿瘤细胞系是重要的环节。然而，除病人新鲜M5细胞外，国际上很少有CD14表达的单核细胞系存在，从而对该研究的深入进行带来困难。目前，大多数研究室仍然通过VitD3诱导单核细胞来源的细胞株U937 来获得CD14阳性表达的细胞系［3］，这不仅不能保证CD14表达的均一性，也不利于人M5白血病动物模型的建立及其体内导向治疗的研究，通过转基因技术建立表达人CD14抗原的鼠肿瘤细胞系是解决这一问题的可行途径。为此，我们利用C57BL/6小鼠黑色素瘤细胞B16的高效转染性，初步建立人CD14抗原阳性表达的鼠细胞系B16/CD14，为CD14阳性白血病动物模型的建立奠定了基础。

　　材料和方法

　　标本、主要试剂及仪器

　　单核细胞来自正常人外周血，进口直标单克隆抗体CD14-PE、γ1-FITC、γ1-PE为美国Becton Dickinson公司产品；2F9-FITC为本实验室研制的直标鼠抗人CD14单克隆抗体试剂；TrizoL液、高保真度Taq DNA 聚合酶、Low DNA Molecular Mass Ladder标准分子量购自Invitrogen公司；M-MLV逆转录酶、RNasin○R核糖核苷酸酶抑制剂、RQ1无RNA酶的DNA酶、pGEM○R-T Easy Vector系统、X-gal（5-嗅-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）、IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）购自Promega公司；QIAquick DNA 纯化试剂盒购于Qiagen公司； RPMI 1640培养基、EcoRI、HindⅢ和XbaⅠ内切酶及G418购于Gibco BRL公司；全自动测序仪（ABI PRISM377）为P-E公司仪器；FACSCabliburTM流式细胞仪购自美国Becton Dickinson公司；哺乳动物表达载体pcDNA 3.1 (+ ) 购自Invitrogen 公司。

　　细胞株及受体菌

　C57BL/6黑色素瘤细胞B16冻存于浙江大学附属邵逸夫医院中心试验室；大肠
　　
　　杆菌DH5α由曹江博士惠赠。

　　引物

　　根据NCBI GenBank检索的人CD14 cDNA序列设计上下游引物，分别含有HindⅢ 和XbaⅠ酶切位点，委托上海生物技术工程有限公司合成： 上游引物为：5′ A↓AGCTTATGGAGCGCGCGTCCTGCTTGTTGCTG 3′ （HindⅢ），下游引物为：5′ T↓CT AGATTAGGCAAAGCCCCGGGCCCCTTGGAGC 3′ （XbaⅠ）。

　　重组质粒pcDNA3.1（＋）/CD14的构建

　　取正常人的外周血2 ml，以等体积的磷酸盐缓冲液（phospholate buffer solution，PBS）稀释，加入2 ml的淋巴细胞分离液，3 000×g离心20分钟，分离得到单个核细胞，以1 ml的TrizoL液溶解细胞，抽提总RNA并进行逆转录，以上述引物进行扩增，得到CD14基因片段。PCR反应条件为：94℃ 5分钟，94℃ 30秒，57℃ 30秒，72℃ 50秒，共30个循环，72℃延伸7分钟。0.8％琼脂糖电泳显示扩增出目的基因片段，取PCR产物2 μl克隆到pGEM○R-T Easy Vector中，命名为pGEM○R-T Easy /CD14，EcoRI酶切结果阳性的克隆纯化后委托上海博亚公司采用ABI PRISM377进行测序

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