慢性髓系白血病首发血小板显著增多

　　骨髓染色体制备：

　　 ① 用0.2%肝素湿润之针筒抽取骨髓，根据细胞计数，将骨髓按（1-2）×106/ml，加入20  ml RPMI  1640培养液，37℃恒温箱放置24小时；② 加入秋水仙碱，终浓度为0.05  μg/ml，于37℃放置1小时；③ 离心： 200×g×10分钟，弃上清液；④ 低渗：加入预温至37℃的0.075 mol/L KCl液8 ml，轻轻打匀，于37℃放置30分钟；⑤ 预固定：加入1 ml固定液轻轻打匀，200×g×10分钟；⑥ 第1次固定：离心后弃上清液，加固定液8 ml，打匀，于室温放置≥30分钟；⑦ 第2次固定： 200×g×10分钟，离心后弃上清液，加固定液8 ml，打匀，于室温放置≥15分钟；⑧ 第3次固定： 200×g×10分钟，离心后弃上清液，加固定液8 ml打匀，室温放置≥15分钟；⑨ 离心： 200×g×10分钟，弃上清，加适量固定液配成细胞悬液，于4℃保存；⑩ 气干法制片后，10%姬姆萨染色20分钟，水洗，干后镜检。

　　荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)  ①探针制备： 采用BCR/ABL双色探针，BCR结合绿色荧光SpectrumGreen，ABL结合红色荧光SpectrumRed，探针购自美国Vysis公司； ②间期FISH： 取出储存于-20℃的染色体标本，换用新鲜的3∶1甲醇/冰醋酸固定液，气干法滴片；37℃ 2×SSC中30分钟老化，70%、85%、100%的乙醇室温下梯度脱水，每梯度2分钟；在变性液（70%的甲酰胺/2×SSC）中72℃变性3分钟，70%、85%、100%的冰乙醇（-20℃）梯度脱水，晾干。按1  μl BCR/ABL双色探针加4  μl杂交稀释液加入Eppendorf管中，瞬时离心混匀.把探针与稀释液的Eppendorf管放入72℃水浴锅中变性5分钟。按每张玻片加5  μl的反应体系后，将该玻片盖紧，用胶封牢后置37℃湿盒中杂交过夜，将杂交后的片子放于72℃，0.3% TritonX-100/0.4×SSC中洗涤2分钟，继之用0.1% Triton X100/2×SSC室温洗涤1分钟。避光晾干后按每片加6  μl DAPI/Antifade复染。 ③荧光显微镜检查：用OlympusBX60荧光显微镜，在DAPI/FITC/Texas Red滤色镜的激发下观察间期细胞的荧光杂交信号，每例分析200-300个细胞，不计数重叠细胞。以患者3个或1个荧光杂交信号的百分率大于每种探针对照组X＋3SD作为克隆性异常的阳性标准。用Kodak Ektapress PJC800负片摄片或应用染色体图像及多彩色荧光原位杂交自动分析仪进行图像采集和分析。

　　分子生物学检测

　　RT-PCR  RNA抽提试剂TRIZOL、Taq 酶、oligodT(36)AGC、引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司提供；M-MLV、dNTPs(Promega公司)；阳性对照K562细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所。TRIZOL 一步法提取患者骨髓细胞总RNA，用紫外分光光度计(Beckman DU650)检测定量之后将RNA统一稀释成1  μg/μl。RT反应：取RNA 2  μl (2  μg)，oligodT(36)AGC 3 μl，ddH2O  9  μl混匀离心，70℃，4分钟，放置冰上3分钟，离心之后冰浴条件下加入5×缓冲液6  μl，dNTPs（5     mmol/L）1  μl，M-MLV 0.5  μl，ddH2O 8.5  μl，总体积为30  μl，42℃ 90分钟后，70℃  5分钟灭活反转录酶。PCR反应：取RT产物2  μl，引物各0.5  μl，5 mmol/L dNTPs 1  μl，10×扩增缓冲液(无MgCl2)5  μl，25 mmol/L MgCl2 7  μl，Taq酶0.5  μl，以ddH2O将体积补充到50  μl，混匀，置PCR仪上（PTC2000型）。95℃预变性5分钟之后，95℃变性45秒，60℃退火45秒，72℃延伸45秒，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。bcr/abl引物序列：bcr引物序列为5’-CTCCAGACTGTCCACAGCATTCCG-3′，abl引物序列为3’-AGACTGAAACTCGGAGTCCCAGAC-5’，abl反义引物序列为3’-TTCGGGAAGTCGCCGGTCATCGT-5’。根据bcr/abl 不同拼接方式，可产生168 bp(b3a2)和93 bp(b2a2)两种转录本。β-actin(271  bp)为内对照，引物序列：有义链：5’-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3’，反义链：5’-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3’。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，紫外照相。

　　结果

　　骨髓涂片及骨髓活检结果

　　骨髓细胞涂片  骨髓增生明显活跃，粒∶红=0.89；巨核细胞530个，分类100个，产血小板巨核细胞42个，血小板成堆大片易见，可见圆形核小巨核细胞。外周血涂片见多量大簇血小板，积聚成大片（图1）。铁染色：胞外铁阴性，胞内铁阴性。NAP阳性率30%，积32分（正常对照60分）。1月后复查骨髓：骨髓增生活跃，粒系59.5%，红系24%，粒∶红=2.48；巨核细胞60个，产血小板巨核细胞15个，可见小巨核细胞，血小板大簇易见。NAP阳性率19%，积19分（正常对照70分）。　骨髓活检 

　　造血组织增生异常，以巨核系异常增生为主。造血组织∶脂肪∶骨小梁为52%∶22%∶24%。巨核细胞较小，多为不分叶圆核型（图2）。

　　RT-PCR结果

　　分别两次骨髓样本RT-PCR结果： bcr/abl融合基因阳性，b3a2型（图3）。

　　染色体核型分析及FISH结果

　　骨髓细胞染色体核型分析：46XX，t(9;22)(q34;q11)［10］。间期FISH证实存在Ph染色体（图4）。

　　治疗

　　入院后立即予治疗性血小板单采以及控制消化道出血、补铁等其他对症处理，并予羟基脲治疗，但患者用药后呕吐频繁被迫停药。为有效控制血小板数，曾予小剂量HA联合治疗[高三尖杉酯碱（H） 1 mg/d，阿糖胞苷（A） 10 mg/12 hours］，10天后血常规示：WBC 1.8×109/L，N 69%，L 27%，M 4%，Hb 61 g/L，plt 542×109/L。以后常规皮下注射-干扰素300万单位，隔日1次，血小板数控制在430×109/L左右，目前单用干扰素维持。贫血经补铁治疗后明显改善。门诊随访半年，病情稳定，贫血完全纠正，血小板数正常。

　　讨 论

　　原发性血小板增多症（ET）是一种慢性骨髓增殖性疾病（MPD），其血小板增高并不是其他MPD的发病原因，也不是诊断性症状。由真性红细胞增多症转贴于 酷文网-论文下载中心 http://www.coolwen.net