流式微珠阵列法检测IFN-γ诱导的Jurkat细胞Th1/Th2细胞因子表达

【摘要】  本研究旨在探讨流式微珠阵列法检测Th1/Th2细胞因子表达及IFN-γ应用于T淋巴细胞白血病治疗的临床价值。以不同浓度IFN-γ诱导培养Jurkat细胞48小时，用流式微珠阵列法检测培养上清液中IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ表达，并采用流式细胞术检测膜上IL-2受体（CD25）的表达。结果表明： IFN-γ诱导Jurkat细胞IL-2和TNF-α的表达呈浓度依赖性升高，未检测到IL-6表达，CD25表达明显升高。结论： Jurkat细胞能被IFN-γ诱导高表达Th1细胞因子和CD25，流式微珠阵列法能准确客观地反映Th1/Th2细胞因子表达的动态变化。

【关键词】  T淋巴细胞白血病

　　Detection of Expression of Th1/Th2 Cytokines in Jurkat cell Treated with γ-Interferon  by Cytometric Bead Array

　　Abstract  In order to explore the value of γ-interferon (IFN-γ)  in therapy of T lymphoid leukemia  and role of  cytometric bead array (CBA) method in detection of Th1/Th2 cytokines expression，the  Jurkat cells were cultured  for 48 hours  in  different  concentration  of  IFN-γ，the expressions of IL-2，IL-6，INF-γ and TNF-α in culture supernatants  were assayed by CBA method; CD25 expression was assayed by flow cytometry.The results showed that the  expressions of IL-2，TNF-α   were enhanced in INF-γ dose-dependent  way，and the expression of CD25  was also enhanced，but there was no expression of IL-6. It is concluded that  Jurkat cells induced by   IFN-γ were able to express high-level  of Th1 cytokine and IL-2 membrane receptor (CD25)，and the CBA method can be used to exactly   evaluate the dynamic change of Th1/Th2 cytokines.

　　Key words cytometric bead array; Th1/Th2 cytokine; IFN－γ; T lymphoid leukemia

    流式微珠阵列（cytometric bead array，CBA）是近年来发展起来的新技术，可在一份标本中同时检测多达10种细胞因子（IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10），具有快速、简便、准确的特点，而且灵敏度高（可达0.3 pg/ml），可以准确反映Th1/Th2平衡状态［1-4］。有学者认为，IFN-γ可应用于T淋巴细胞白血病治疗，但目前为止并无确凿的实验证据。Jurkat细胞株为T淋巴瘤研究常用模型，因此本研究组以流式微珠阵列法检测IFN-γ诱导的Jurkat细胞Th1/Th2细胞因子表达，同时检测mIL-2R（IL-2膜上受体，CD25）表达，探讨IFN-γ的抗肿瘤效应及作用机制。

　　材料和方法

　　材料

　　RPMI 1640液体培养基（杭州科达生物公司产品），临用前加入15%小牛血清（杭州四季青生物工程公司产品）； Jurkat 细胞株（中国科学院上海细胞生物学研究所提供）； IFN-γ（上海克隆生物高技术有限公司生产）； 流式微珠阵列细胞因子检测试剂盒（Bender Medsystems产品，Austria）；CD25 FITC单克隆抗体（美国Becton Dickinson公司产品）。
细胞培养

　　以含15%灭活小牛血清的完全RPMI 1640培养液，于37℃、5% CO2、饱和湿度下培养Jurkat细胞，每2-3天换液，取对数生长期的细胞进行实验。

　　给药处理

　　IFN-γ以完全RPMI 1640培养液配成1×106 U/ml

　　贮存液，4℃避光保存。以1×106/ml浓度接种对数生长期细胞于6孔板中，培养6小时后给药。各孔药物终浓度分别为0(对照组)、1 000、2 000、4 000、6 000、10 000 U/ml，继续培养48小时，收集细胞用于CD25检测，细胞培养上清液用于细胞因子检测。

　　IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-2的流式微珠阵列检测

　　按试剂盒操作说明准备好检测缓冲液、微珠、生物素偶联剂和亲和素标记藻红蛋白（phycoerythrin，PE)，以检测缓冲液预湿微孔板，加入不同浓度细胞因子标准品或25 μl待测细胞培养上清液，同时每孔加入25 μl微珠和50 μl生物素偶联剂，室温振摇（500 rpm）孵育2小时，真空吸干液体，充分洗涤2次，每孔加入100 μl检测缓冲液和50 μl亲和素标记PE，继续孵育1小时，真空吸干液体后洗涤2次，加入200  μl检测缓冲液并转移到试管中，FACScan (Becton Dickinson，USA) 流式细胞仪测定荧光强度，荧光通道为FL-2，采用Flowcytomix Pro分析软件（联科公司附赠）进行分析。

　　药物处理48小时后Jurkat细胞CD25表达的流式细胞术检测

　　收集1×106细胞，用PBS洗涤1次后，加入CD25 FITC单克隆抗体，孵育15分钟，充分洗涤后，FACScan流式细胞仪测定荧光强度，激发波长为408 nm，采用Cellquest分析软件进行分析。　统计学处理

　　每次实验均独立重复3次，以Excell软件和Flowcytomix Pro分析软件处理实验数据。

　　结 果

　　IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-2的流式微珠阵列检测

　　利用Flowcytomix Pro分析软件建立各细胞因子荧光值与其实际浓度的标准曲线（图1），各待测样本细胞因子浓度根据其荧光值由标准曲线自动读出，未以IFN-γ处理的Jurkat细胞中4种细胞因子均不表达，而加入IFN-γ后随浓度的升高，上清液中IL-2和TNF-α浓度明显升高，未检测到IL-6表达（图2）。

　　CD25检测

　　IFN-γ在1 000-10 000 U/ml浓度下有诱导Jurkat细胞表达CD25分子的作用。IFN-γ浓度为6 000 U/ml时诱导作用最强，48小时培养后CD25表达率提高8%。IFN-γ浓度大于6 000 U/ml浓度之后，CD25分子表达率不再升高（图3）。

共2页: 上一页 1 [2] 下一页