硫化砷对骨髓增生异常综合征骨髓单个核细胞体外凋亡的作用

    作者：袁红建，徐瑞容，丁润生，姜胜华，陆伟    

【摘要】  为了研究硫化砷（As2S2）在体外对骨髓增生异常综合征患者骨髓单个核细胞增殖的影响，并探讨其可能的作用机制，采用MTT法、流式细胞术、RT-PCR等多参数检测不同浓度As2S2诱导MDS细胞的凋亡。结果表明：①低浓度（0-0.6 mg/L）的硫化砷对MDS细胞无明显抑制作用；②相对高浓度的硫化砷（1.5-50 mg/L）对低危组MDS以及高危组MDS的单个核细胞均有诱导凋亡作用，且呈时间浓度依赖关系；bcl-2 mRNA 在As2S2 作用后表达明显下调，bcl-2/bax比例明显下降(P<0.05)；③MDS病人存在骨髓造血细胞的过度凋亡。结论：MDS病人存在骨髓造血细胞的过度凋亡；低浓度的硫化砷对MDS细胞没有明显的增殖抑制作用，高浓度的硫化砷主要通过诱导凋亡使MDS细胞死亡。

【关键词】  骨髓单个核细胞

　　Apoptosis of  In Vitro Cultured BMMNC from MDS Patients  Induced by Arsenic Sulfide

　　Abstract The aim of this study was to investigate the inhibition effect of arsenic sulfide (As2S2) on the growth of  in vitro cultured BMMNC from MDS patients and to explore its possible cellular and molecular mechanisms．The apoptosis of MDS cells induced by As2S2 solution of different concentrations were studied with MTT，flow cytometry，and RT-PCR.The results showed that (1) low concentration of As2S2（0-0.6 mg/L）had no marked  inhibition effect on proli-feration of MDS cells；(2) after treatment with 1.5-50 mg/L of As2S2，both low risk MDS cells and high risk MDS cells presented typical features of apoptosis with a dose-dependent manner，the expression of bcl-2 mRNA and the ratio of bcl-2/bax  obviously decreased after As2S2 treatment (P<0.05); (3) BMMNC from MDS patients had higher apoptosis ratio than that of BMMNC from control.It is concluded that  BMMNC excessive apoptosis exists in MDS patients; low concentration of As2S2（0-0.6 mg/L） shows no  inhibition effect on proliferation of MDS cells；high concentration of As2S2（1.5-50 mg/L） induces apoptosis of MDS cells.

　　Key words myelodysplastic syndromes ;arsenic sulfide; BMMNC; apoptosis;  bcl-2;  bax

    骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes，MDS)是一种造血干细胞异常克隆性与异质性疾病，其主要特征为病态造血和无效造血，部分患者易向白血病转化。MDS发病率有逐年上升趋势［1］，但目前对其治疗仍无很好的方法。经研究发现，砷剂具有致癌、致畸、致突变的协同作用；作为微量元素，砷尚能促进造血、细胞生长和繁殖［2］。硫化砷（As2S2）是中药雄黄的主要成分，近年来，用雄黄治疗MDS取得了一定的疗效［3］，本研究以观察硫化砷（As2S2）在体外对MDS骨髓单个核细胞的作用，查明其可能的治疗机理，开发其应用领域。

　　材料和方法

　　病例选择

　　MDS患者25例，按照FAB分型［4］，RA 15例，RAS 3例，RAEB 5例，RAEB-t 2例。男性16例，女性9例，中位数年龄45（19-80）岁，为初诊及复诊的患者，每例均经骨髓细胞形态学和骨髓病理等相关的实验室检查确诊。以上病例来自南通大学附属医院血液科。

　　标本采集和细胞分离

　　自髂后上棘抽取5 ml骨髓液，0.1%肝素抗凝，采集后2小时内用淋巴细胞分离液密度梯度离心分离骨髓单个核细胞，RPMI 1640培养液洗3遍，制成细胞悬液，计数备用。

　　试剂

　　硫化砷（As2S2）购自美国Sigma公司，纯度99.99%，以0.2 mol/L NaOH 溶解，HCl中和滴定至pH  7.35-7.45，制成0.1%的储存液，4℃保存。MTT购自美国Sigma公司，临用前以PBS配制成5 mg/ml，抽虑除菌，保存在4℃条件下。RT-PCR试剂盒购自晶美公司，AnnexinV FITC试剂盒购于联科生物公司。

　　MTT增殖抑制实验 

　　硫化砷分成7种不同浓度（0.3、0.6、1.5、3.0、15、30、50）mg/L组，加上调零孔（没有细胞和药）和对照孔（不加药），共为9组，每组设5个复孔。分离的骨髓单个核细胞以每孔1 000-10 000个接种到96孔板，每孔体积200 μl，培养液为含不同浓度的硫化砷的RPMI 1640（含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素）；37℃，5% CO2条件下分别培养24、48、72小时，每孔再加入MTT 20 μl，孵育4小时，小心弃上清，加二甲亚砜150 μl振荡溶解10分钟，用酶标仪测490 nm波长A值，取5孔A490的均值，计算抑制率。抑制率=（阴性对照的A值-实验孔的A值）/阴性对照的A值×100%。

　　流式细胞术检测

　　分离的骨髓单个核细胞以（2-5）×105/mL浓度接种在含硫化砷的RPMI 1640培养液中进行培养（37℃，5%  CO2），分别取培养前（0小时）、培养后24小时、48小时的 细胞，以Annexin V-PI进行标记后，用流式细胞仪检测。

　　荧光共聚焦显微镜观察
 
　　硫化砷处理后的细胞和未经处理的细胞以 Annexin V 和PI标记，收集细胞涂片，用荧光共聚焦显微镜观察并拍摄图片。

　　RNA抽提和bcl-2与bax mRNA 转录的RT-PCR检测

　　用TrizoL试剂盒(Gibco公司)提取细胞总RNA后测定其浓度和纯度(紫外分光光度仪，Pharmasia公司)。RT反应体系包括RNA 1-5 μg，oligo(dT)18  Primer (0.5 μg/μl 1 μl，5×缓冲液 4 μl，dNTP (l0 mmol/L) 2 μl，RNasin (20 U/μl 1 μl，M-MuLV逆转录酶(200 U/μl  1μl，总体系20 μl；RT-PCR引物见表1。50 μl  PCR体系包括：逆转录反应产物2 μl，上游及下游引物(10 pmol／L)各2 μl，dNTP (10 mmol/L) 0.8 μl，Taq DNA合成酶(25 U/μl  0.5 μl，MgCl2 (25 mmol/L) 3 μl，10×PCR buffer 5 μl；反应参数：95℃预变性5分钟，94℃ 40秒，55℃ 40秒，72℃ 40秒，72℃ 7分钟，各反应32个循环；反应产物各取10 μl，1.8％琼脂糖凝胶电泳，电压100 V；凝胶成像系统(Bio-Rad公司)记录并对条带作半定量转贴于 酷文网-论文下载中心 http://www.coolwen.net

共3页: 上一页 1 [2] [3] 下一页

网摘收藏: