酪氨酸激酶抑制剂逆转黏附诱导的骨髓瘤细胞的耐药性

　　细胞培养

　　多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226细胞来源于ATCC，由第四军医大学病理学教研室惠赠。细胞培养于含100 ml/L灭活胎牛血清的RPMI 1640培养液中，置5% CO2、饱和湿度、37℃培养箱中悬浮培养，2-3天传代1次，实验用细胞处于指数生长期。

　　黏附实验

　　用无菌过滤的TSM buffer(20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1  mmol/L CaCl2，2 mmol/L MgCl2，pH 8.0 )［2］分别配制50 μg/ml的FN及1% BSA，每孔50 μl包被96 孔板，4℃过夜，用 1% BSA封闭2小时。实验分为4组：①FN组：单纯用FN  (50 μg/ml)包被；②对照组（BSA组）：单纯用1% BSA包被；③STI571+FN组；④STI571+BSA组。RPMI8226细胞经无血清RPMI 1640培养12小时，并以20  μmol/L 浓度的STI571(行细胞毒预实验测得)预孵育2小时后，按2.0×104细胞/孔，种入96孔板，每组平行3孔。37℃、5% CO2分别培养1、6、12小时（期间不去除STI571）。用RPMI 1640 培养液洗板3次，70%甲醇固定10分钟，洗板晾干。0.02%结晶紫染色10分钟［1］，PBS 洗去多余染料，再以0.2% Triton X-100溶解细胞，酶联免疫仪上测定各孔570 nm OD值，以含2.0×104细胞/孔为总OD值（100%）。细胞黏附率(%) =实验组OD值/总OD值×100%。

　　MTT检测

　　实验分4组，每组设3个复孔：①FN+Adr组；②BSA+Adr组；③STI571+Adr+FN组；④STI571+Adr+BSA组。FN包被及STI571处理同前。取指数生长期RPMI8226细胞按1.0×104细胞/孔种入96孔板，黏附12小时，每组分别加入以下浓度Adr：0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 μmol/L，作用1小时，离心弃上清，加完全RPMI 1640液培养24小时后，加入MTT溶液（5  mg/ml）10 μl，37℃孵育4小时，每孔加入100 μl 10% SDS（含0.01  N  HCl），充分溶解结晶物［3］，570 nm波长测定各孔OD值，实验重复3次，取平均值。生长抑制率(％)=(1-试验组A值/对照组A值)×100％。

　　RT-PCR检测

　　取指数生长期细胞分为20 μmol/L STI571处理组与空白对照组，1×106个细胞培养14小时后，采用TRIzoL试剂提取总RNA。RNA反转录按试剂盒说明书进行。将反转录产物cDNA于95℃变性5分钟，开始PCR的热循环：94℃变性40秒，51℃退火40秒，72℃延伸40秒，共28个循环，最后一个循环72℃延伸10分钟，4℃保存。Rac1及GAPDH引物设计参照文献［4］。Rac1上游引物为5′-AGG AAG AGA AAA TGC CTG-3′，下游引物为5′-AGC AAA GCG TAC AAA GGT-3′，产物长度为80 bp；GAPDH上游引物为5′-TCG GAG TCA ACG GAT TTG GTC GTA-3′，下游引物为5′-TGG CAT GGA CTG TGG TCA TGA GTC-3′，产物长度为525 bp。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统进行灰度值扫描，并以软件Genetools分析，以目的条带与内参照条带的比值（Rac1/GAPDH）代表目的基因mRNA相对水平。

　　统计学分析

　　应用SPSS 10.0处理数据，行T-test分析。　结果

　　STI571对RPMI8226细胞黏附的抑制作用

　随着时间延长，RPMI8226细胞与FN的黏附率逐渐上升，1、6、12小时黏附率分别为(43.71±2.18)%、(55.63±1.56)%、(63.42±2.46)%；20 μmol/L STI571处理组1、6、12小时后黏附率分别降为(15.12±1.04)%、(17.58±1.32)%、(17.24±1.59)%；与对照组相比相差显著(P＜0.05)，表明STI571能显著降低RPMI8226细胞与FN的黏附（图1）。

　　STI571逆转RPMI8226细胞CAM-DR

　　经Adr作用后，BSA对照组RPMI8226细胞凋亡，并有良好的浓度依赖关系，其IC50为［（0.78±0.03）μmol/L］；靶细胞与FN黏附后Adr诱导的细胞凋亡明显减弱，其IC50［（1.46±0.04）μmol/L］显著高于BSA组(P＜0.05)，表明靶细胞黏附能提高其耐受Adr细胞毒作用，即产生了细胞耐药；而FN联合STI571处理组IC50［(0.81±0.05)μmol/L］，明显低于FN组(P＜0.05)，说明STI571能逆转骨髓瘤细胞因黏附介导的耐药；BSA联合STI571组IC50 ［（0.74±0.02）μmol/L］与BSA组［（0.78±0.03) μmol/L］相比无显著性差异（P＞0.05），说明STI571下调靶细胞IC50作用并非是由于STI571与Adr的协同作用所引起的（图2）。

　　STI571下调RPMI8226细胞Rac1  mRNA表达

　　Rac1  mRNA在RPMI8226细胞中高表达，其RP-PCR产物相对灰度值为1.65±0.15 (lane 1)，20  μmol/L STI571处理瘤细胞14小时后灰度值降为0.81±0.18(lane 2)，表明STI571能够下调靶细胞Rac1 mRNA 表达（图3）。

　　讨论

　　Abl属于非受体型蛋白酪氨酸激酶家族成员，大部分定位于核内，少部分在胞浆。其功能因Abl在细胞内定位不同而不同，核内Abl主要涉及细胞周期、凋亡等过程，而胞浆Abl则参与细胞黏附、细胞骨架重构调控。细胞功能状态影响Abl定位及生物学活性。例如，成纤维细胞和FN黏附结合后，Abl激酶活性可上升1.9-6.8倍［5，6］，并能快速从核内到胞浆，结合到纤维状肌动蛋白（filament actin，F-actin），促使F-actin聚合及粘着斑(focal adhesion)形成［7，8］。这表明Abl激酶在细胞黏附过程中发挥着重要作用。

    鉴于不同类型细胞的黏附过程可能具有某些共同的生物学特征，我们推测Abl激酶也可能参与MM细胞的黏附调控过程。2002年De-Vos等［9］采用寡核苷酸阵列分析技术证实，Abl基因在恶性浆细胞中的表达高于正常浆细胞2.9倍。这一事实为研究Abl与MM细胞黏附间的关系提供了生化基础。那么能否用Abl酪氨酸激酶抑制剂STI571来抑制骨髓瘤细胞的黏附，从而逆转其CAM-DR？我们用FN黏附RPMI8226细胞1、6、12小时，黏附率依次递增，分别为(43.71±2.18)%、(55.63±1.56)%、(63.42±2.46)%；而对应的STI571处理组黏附率分别为(15.12±1.04)%、(17.58±1.32)%、(17.24±1.59)%；组间差异显著，说明STI571能明显抑制MM细胞的黏附，与此同时，靶细胞对阿霉素的IC50下降。这一结果表明，STI571能够部分逆转MM细胞的耐药性，也为进一步研究Abl调控F-actin聚合以及CAM-DR形成提供了初步依据。转贴于 酷文网-论文下载中心 http://www.coolwen.net