姜黄素调节B淋巴瘤细胞p300和HDAC1的研究

　　细胞体外生长活性检测 

　　采用溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)比色法，取对数生长期的Raji细胞进行实验，将不同浓度的姜黄素6.25-50 μmol/L加入10% FCS的RPMI 1640完全培养液中，调细胞浓度为5×105/ml，接种于96孔板，每种药物浓度为一组，每个浓度设3个平行孔，置5% CO2、37℃培养箱培养不同时间(0、6、12、24及48小时)后，每孔加MTT 20 μl，培养4小时，弃MTT，每孔加二甲亚砜150 μl，充分溶解。选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔A值。肿瘤细胞的生长抑制率=（1-实验组平均A值/对照组平均A值）×100%。

　　细胞凋亡的流式细胞仪检测 

　　用Annexin-V-FITC及PI双标流式细胞仪检测细胞凋亡，分为实验组和阴性对照组。分别加入终浓度为6.25-25  μmol/L的姜黄素作用于24小时，用70%乙醇4℃固定24小时，PBS缓冲液洗去固定液，离心去上清。用缓冲液37℃孵育60分钟，195 μl细胞悬液加5 μl  Annexin-V-FITC。混匀，室温放置10分钟。用缓冲液洗涤细胞1次，在190 μl缓冲液重悬，然后再加10 μl 20 μg碘化丙锭。上流式细胞仪检测。
 
　　p300及HDAC1 mRNA表达的RT-PCR检测 

　　细胞总RNA抽提及RT-PCR　步骤按TrizoL (Gibco公司)试剂盒说明书进行，所提取的总RNA溶解后用紫外分光光度仪测RNA纯度和浓度(A260/A280>1.8)。在GenBank检索基因cDNA序列，自行设计PCR引物，由上海生物工程公司合成。p300引物序列(上游引物: 5′-GGGCTCAACCGACAA GAC-3′，下游引物: 5′-GGAGGCAGAGGCAATCAA-3′，扩增产物为259 bp。β-actin引物序列上游引物:5′-TGAGACCTTCAACACCCCAG-3′；下游引物: 5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3′，扩增产物为312 bp。PCR扩增条件为：94℃ 30秒，94℃ 变性1分钟，57℃复性 30秒，72℃ 50秒，72℃延伸10分钟，共进行35个循环。HDAC1引物序列(上游引物: 5′-AGTGCGGTGGTCTTACA GTG-3′，下游引物: 5′-TCTCCCTCCTCTTCAGAATCG-3′，扩增产物为500 bp。β-actin上游引物:5′-TGAGACCTTCAACACCCCAG3-′；下游引物: 5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3′，扩增产物为316 bp。PCR扩增条件为：94℃ 5分钟，94℃ 变性1分钟，50℃复性 1分钟，72℃ 延伸1分钟，共进行32个循环。产物用1%的琼脂糖胶，进行检测。用数码凝胶图象分析系统（Kodak  EDAS290）作条带密度扫描，结果以目的条带与对应的β-actin密度值表示。　细胞蛋白质样品制备及蛋白定量 

　　经处理后的细胞立即弃去培养液，洗涤，离心。加预冷的细胞裂解液(0.1 mol/L NaCl，0.01 mol/L Tris HCl，pH 7.6，0.001 mol/L EDTA，100 μg/ml PMSF，2 μg/ml leupeptin) 0.1 ml，裂解30分钟，然后10 000×g离心10分钟，取上清备用。以上所有操作均在4℃下进行。测定蛋白，并调各组蛋白浓度一致。

　　Western blot检测 

　　按文献[5］报道的Western blot方法检测p300，HDAC1其中一抗为鼠抗，二抗用辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG，经化学发光法，X线曝光显影，软件进行扫描定量，每个浓度组重复3次，取均值代表测定结果。

　　统计学分析

　　应用Excel 2000软件作方差分析和t检验。

　　结果

　　Raji细胞生长抑制率的测定

　　姜黄素以时间剂量依赖性方式抑制Raji细胞增殖，6、12、24和48小时后，细胞抑制率分别如下：6.25 μmol/L时为(1.25±0.7)%、(6.79±0.9)%、(18.25±1.0)%、(23.15±1.9)%；12.5 μmol/L时为(4.28±0.6)%、(15.24±1.4)%、(30.25±2.0)%、(40.12±1.0)%；25 μmol/L时为(10.25±1.1)%、(29.14±2.3)%、(51.25±2.8)%、(63.58±2.9)%；50 μmol/L时为(17.25±2.0)%、(45.78±2.7)%、（63.58±3.5)%、(78.63±3.6)%，差异有显著性意义(P<0.01)，24小时IC50为25 μmol/L(图1)。

　　Raji细胞凋亡率的变化

　　细胞凋亡率随姜黄素浓度增高而逐渐增加，两种浓度（12.5和25 μmol/L）的药物与对照组比较均能明显诱导细胞凋亡(P<0.05)，但 6.25 μmol/L姜黄素引起的凋亡率与对照组的差异无显著意义(P>0.05)（附表）。Table. Apoptosis ratio of Raji cells (%) inducted by various concentration of curcumin  at 24 hours（略）

　　姜黄素对Raji细胞p300及HDAC1  mRNA表达的影响

　　姜黄素IC50浓度时，光密度扫描显示第6小时的HDAC1和p300  mRNA表达已经下降，随着时间延长，表达逐渐降低，呈时间依赖性（图2）。

　　姜黄素对Raji细胞p300及HDAC1蛋白表达的影响

　　姜黄素IC50浓度处理Raji细胞6小时后p300和HDAC1蛋白表达开始下降，随着作用时间的延长，其表达呈时间依赖性降低(图3)。

　　讨 论

　　姜黄素(curcumin，cur) 系从中药姜黄中提取的酚性色素，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、降血脂等广泛的药理作用，最近美国国立肿瘤所(NCI)将其列为第三代防癌药物，进行临床研究。大量资料证明，姜黄素能直接抑制肿瘤细胞的长，并能诱导细胞的凋亡，其作用机制主要是调控癌基因和抑癌基因［6，7］。此外，姜黄素还能抑制人类免疫缺陷病毒Ⅰ型和细胞有丝分裂的产生及抑制核转录因子NF-κB和AP-1的活性［8］。本实验通过细胞增殖实验研究姜黄素的抗肿瘤的机制，结果表明姜黄素能有效抑制Raji细胞增殖，诱导其发生凋亡，且呈明显的量效关系和时间依赖性，与文献报道一致［9］。
   
　　p300是一种具有组蛋白乙酰化酶活性的转录因子，对重要生物功能如细周期调控、细胞分化、凋亡等具有重要作用［10］。p300的一个特征是具有HAT的活性，通过募集p300相关辅助因子(PCAF)对靶组蛋白进行乙酰化，多种转录因子的乙酰化调节都与p300有关。Xiao等［11］发现，p300是HDAC抑制剂TSA诱导和SP1介导的P21WAF1转录所必需的，p300共转染可升高P21WAF1启动子活化，而且可以导致P21WAF1相关蛋白H3和H4高乙酰化。研究表明，在急性白血病、乳腺癌、肝癌和直肠癌中p300可发生多种形式的基因变异［3］。姜黄素作为一种新型、低效的抗癌药物，作用于生物体细胞时，细胞内的p300的表达水平如何变化？本研究结果发现，姜黄素 IC50浓度以时间依赖作用抑制Raji细胞p300的表达，最早在12小时时即显示对p300的抑制作用，48小时时抑制水平最高。RT-PCR检测发现，p300 mRNA和蛋白水平显著下降，提示姜黄素可能是通过下调p300 mRNA的表达及阻断其蛋白产物抑制细胞增殖，诱导其凋亡细胞，其发生的机制可能是通过阻断p300的转录激活，降低诱导基因表达，从而抑制肿瘤细胞生长。转贴于 酷文网-论文下载中心 http://www.coolwen.net