姜黄素调节B淋巴瘤细胞p300和HDAC1的研究

 作者：吴青，陈燕，李新刚，唐元艳

【摘要】  p300是一种具有组蛋白乙酰化酶活性的转录辅助因子，HDAC1是一种组蛋白去乙酰化酶。本研究查明姜黄素对B-NHL细胞株Raji细胞增殖的影响，并探讨这种影响与p300以及HDAC1转录调节表达的关系。 以不同浓度(6.25-50 μmol/L)的姜黄素作用于体外培养的Raji细胞，用MTT法检测细胞生长抑制率，Annexin-V-FITC/PI双标流式细胞术检测细胞的凋亡率和应用RT-PCR 和Western blot法检测Raji细胞中HDAC1和p300的mRNA表达和蛋白含量的变化。结果表明： 姜黄素对Raji细胞抑制作用呈明显的时效和量效关系。24小时的IC50为25 μmo/L；姜黄素能够诱导Raji细胞凋亡，凋亡率为14.38%-61.18%，并呈浓度依赖性。姜黄素明显抑制HDAC1和p300的活性和表达。在IC50浓度时，随着时间的延长，其p300和HDAC1 mRNA表达和蛋白含量逐渐降低，呈时间依赖性，与对照组相比有显著性(P<0.05)。结论： 姜黄素对B细胞淋巴瘤细胞系Raji细胞具有抗肿瘤细胞的增殖作用，并促进其凋亡。姜黄素能够抑制转录共激活因子p300及组蛋白去乙酰化酶HDAC1活性和表达，可能是其作用机制之一。

【关键词】  B淋巴瘤

　　Regulatory Effect of Curcumin on p300 and HDAC1 in B-NHL Cells

　　Abstract The purpose of this study was to investigate the effect of curcumin on proliferation of B-NHL Raji cell line and explore the relationship between this effect and regulatory expression of p300 and HDAC1 transcription.The in vitro cultured Raji cells were treated with curcumin at various concentrations (6.25-50 μmol/L) and at different time points (0，6，12，24 and 48 hours)，the inhibitory ratio of cell growth was measured by MTT assay，the cell apoptosis rate was detected by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI  double staining，the changes of p300 and HDAC1 mRNA expression and protein level in Raji cells were determined by RT-PCR and Western blot.The results showed that the curcumin could inhibit Raji cell proliferation in significant time-and concentration-dependent manners，IC50 at 24 hours was 25 μmol/L; the curcumin could induce apoptosis of Raji cells in concentration-dependent manner，apoptosis rate was 14.38%-61.18%.The curcumin  significantly inhibited activity and expression of p300 and HDAC1.At IC50 concentration，expression of p300 and HDAC1 mRNA and protein level decreased with  time-dependent manner，difference between tested and control groups was significant (P<0.05). It is concluded that the curcumin can inhibit proliferation of  B-NHL Raji cells and promote  apoptosis of those cells.Curcumin  can inhibit  the activity and expression of the transcriptional co-activator p300 and HDAC1，which  may be involved in its pharmacological  mechanisms  on B lymphoma cells.

　　Key words  curcumin; B-NHL; Raji cell; p300; HDAC1

    姜黄素(curcumin，Cur)是从姜黄根茎中提取的一种酚性色素，其药理作用特性有抗炎、抗肿瘤、抗动脉硬化、抗病毒等。体外研究表明，姜黄素抑制癌细胞增殖和诱导凋亡是通过多条通路和调节多种肿瘤表面标记因子实现的，而且其作用靶点可以从DNA、mRNA到蛋白质水平［1］。

    p300是一种重要的组蛋白乙酰基转移酶，它能乙酰化核心组蛋白N末端的赖氨酸残基使核小体组蛋白与DNA的结合稳定性下降，进而使转录机器与染色体的结合成为可能［2］。在细胞中可与多种基因转录活化因子结合而形成辅化因子复合体。除乙酰化作用外，p300还可以在转录起始复合体的形成中起支架或桥梁的作用［2］。目前研究表明，在多种肿瘤中p300可发生多种形式的基因突变，提示

　　p300具有促进基因转录的作用［3］。

    组蛋白乙酰化酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)在真核细胞基因的转录调控中发挥重要的作用，调节核内蛋白质的乙酰化水平与基因转录。近年来研究发现，HAT/HDAC活性紊乱会使基因表达失控，从而导致癌症的发生［4］。

    本研究查明姜黄素对Raji细胞组蛋白去乙酰化酶HDAC1的作用，观察转录共激活因子p300的表达情况，探讨姜黄素抗肿瘤的分子机制。

　　材料和方法

　　材料

　　药物 

　　姜黄素，购自Sigma公司，纯度>99%，溶解于二甲亚砜（DMSO），分装备用。

　　细胞系 

　　B细胞淋巴瘤细胞株Raji细胞购自上海科学院细胞中心。在含有10%的胎牛血清、青霉素100 U/ml及链霉素100 U/ml的RPMI 1640培养液中37℃、5% CO2条件下培养。每48小时换液传代1次。取生长良好、细胞活性大于98%的细胞进行实验。

　　主要试剂 

　　RPMI 1640培养液(Gibco产品)，胎牛血清(中山凌飞公司产品)，溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT，Sigma产品) 组蛋白去乙酰化酶HDAC1抗体，p300抗体均购自Santa Cruze公司，其中HDAC1为鼠抗人单克隆抗体，p300为兔抗人多克隆抗体，羊抗鼠及兔抗鼠二抗和Bio-Rad蛋白定量试剂盒、TRIzoL均购自晶美公司。

　　方法

　　细胞培养 

　　将Raji细胞接种于含10%灭活胎牛血清的RPMI 1640培养液中，在5% CO2、37℃、饱和湿度下培养，每2天换液1次，取对数生长期的细胞进行实验，分别用不同浓度的姜黄素处理细胞，未加药组为对照组。根据MTT法测得的姜黄素对Raji细胞作用的IC50为25 μmol/L，并用IC50浓度的姜黄素作用0、6、12、24及48小时，检测HDAC1和p300蛋白及mRNA的变化。转贴于 酷文网-论文下载中心 http://www.coolwen.net

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