HPLC法测定阿莫西林舒巴坦酯片人体血药浓度

    1.5 血浆样品处理与测定

    1.5.1 阿莫西林血浆样品处理与测定 精密量取上述储备血浆样本0.5ml，加入0.5mol/L高氯酸溶液0.5ml沉淀蛋白，旋涡震荡30s,9000r/min离心5min,取上清液50μl,按“1.3.1”项下色谱条件分离，记录色谱图。

    1.5.2 舒巴坦血浆样品处理与测定 精密量取上述储备血浆样本0.5ml，加入0.5mol/L HCl溶液0.5ml，旋涡震荡30s,然后加入3ml乙醚提取2次，每次旋涡震荡60s，3000r/min离心5min,吸取乙醚2.5ml。合并两次提取液，40℃水浴蒸干乙醚，残留物加200μl流动相充分溶解，40μl进样，按“1.3.2”项下色谱条件分离，记录色谱图。

    1.6 血浆样本测定方法学考查

    1.6.1 专一性考查 （1）取阿莫西林对照品溶液进样，按“1.3.1”项下方法进行色谱分离，得阿莫西林对照品色谱峰。另分别取空白血浆、阿莫西林血浆样本和舒巴坦血浆样本，按“1.5.1”项下方法操作，按“1.3.1”项下色谱条件进行色谱分离，记录色谱图。（2）取舒巴坦对照品溶液，进样，按“1.3.2”项下方法进行色谱分离，得舒巴坦对照品色谱峰。另分别取空白血浆、舒巴坦血浆样本和阿莫西林血浆样本，按“1.5.2”项下方法操作，按“1.3.2”项下方法进行色谱分离，记录色谱图。 1.6.2 标准曲线的制备 （1）阿莫西林标准曲线的制备，精密吸取空白血浆0.5ml，准确加入阿莫西林对照品溶液配制阿莫西林血浆系列浓度（C）为0.125、0.25、1、4、10μg/ml，按“1.5.1”项下方法操作，按“1.3.1”项下方法进行色谱分离，记录色谱峰，得峰面积为（A），以A对C回归，得回归方程。（2）舒巴坦标准曲线的制备，精密吸取空白血浆0.5ml，准确加入舒巴坦对照品溶液配制舒巴坦血浆系列浓度（C）为0.1、0.4、1、4、10μg/ml，按“1.5.2”项下方法操作，按“1.3.2”项下方法进行色谱分离，记录色谱峰，得峰面积为（A），以A对C回归，得回归方程。

    1.6.3 回收率测定 取高、中、低3种浓度的阿莫西林血浆样本5份，按“1.5.1”项下方法操作，按“1.3.1”项下色谱条件进行色谱分离，记录色谱图。得峰面积为（A），将A代入标准曲线方程，计算测得浓度（C），计算阿莫西林血浆样本回收率。另配制高、中、低3种浓度的舒巴坦血浆样本5份，按“1.5.2”项下方法操作，按“1.3.2”项下色谱条件进行色谱分离，记录色谱图。得峰面积为（A），以上述同样方法计算舒巴坦血浆样本回收率。

    1.6.4 精密度测定 按“1.6.3”方法配制阿莫西林和舒巴坦高、中、低3种浓度的血浆样本，照前述方法分别处理阿莫西林和舒巴坦血浆样品及色谱分离，得色谱图峰（A）分别于1日内测定5次和5日内测定5次，计算日内和日间测得浓度（C），求出日内和日间RSD。

    1.6.5 受试者血浆样品测定 （1）阿莫西林血浆样本测定，取“1.4”项下储备的血浆样本，按“1.5.1”和“1.3.1”项下方法操作，得色谱峰面积（A），代入阿莫西林标准线，得阿莫西林血浆样本浓度。（2）舒巴坦血浆样本测定，取“1.4”项下储备的血浆样本，按“1.5.2”和“1.3.2”项下方法操作，得色谱峰面积（A），代入舒巴坦标准曲线，得舒巴坦血浆样本浓度。

    2 结果

    2.1 色谱行为

    2.1.1 阿莫西林的色谱图 见图1。由图1可见血浆中阿莫西林的保留时间为5.58min,与血浆中杂质及舒巴坦色谱峰分离良好，分离度>1.5。

    2.1.2 舒巴坦的色谱图 见图2。由图2可见,血浆中舒巴坦的保留时间为6.710min与血浆中杂质峰分离良好,分离度>1.5。此条件未见阿莫西林色谱峰。

    2.2 标准曲线

    2.2.1 阿莫西林标准曲线 回归方程为C=6.67×10-3+2.43×10-5A,r=0.9998.在0.125～10μg/ml血浆浓度范围内线性良好,最低检测浓度为0.125μg/ml。

    2.2.2 舒巴坦标准曲线 回归方程为C＝2.43×10-3-3.13×10-4A，r＝0.9999。在0.1～10μg/ml血浆浓度范围内线性良好，最低检测浓度为0.1μg/ml。

    2.3 回收率测定 阿莫西林和舒巴坦血浆回收率测定结果见表1。从表1可见两药回收率均在95%～105%范围内。

    2.4 精密度测定 阿莫西林和舒巴坦的血浆精密度结果见表2。由表2可见两药日内、日间RSD<5%。 表1 阿莫西林和舒巴坦方法回收率 表2 阿莫西林和舒巴坦日内和日间变异

    2.5 血浆样品测定 20份血浆样品测定结果见表3。由表3可见，受试者口服阿莫西林舒巴坦酯片2片后60min阿莫西林血药浓度达高峰，高峰浓度为4.55μg/ml。45min舒巴坦血药浓度达高峰。高峰浓度5.63mg/ml。表3 阿莫西林和舒巴坦血药浓度

    3 讨论

    本实验建立了阿莫西林舒巴坦片中阿莫西林和舒巴坦血浆药物浓度的反相高效液相色谱测定方法。利用Spberiseb ODS色谱柱及乙腈-0.068mol/L KH2PO4(4.5:95.5)流动相系统，能够将血浆中杂质、血浆中舒巴坦和阿莫西林有效分离，分离度均大于1.5，且阿莫西林的柱效大于3000。利用Hypersil C18色谱柱及乙腈-0.068mol/L KH2PO4(4.5:95.5)流动相系统，能够将血浆中杂质与血浆中舒巴坦有效分离，分离度大于1.5，且舒巴坦柱效大于3000，而在舒巴坦的提取方法和色谱分离条件下，阿莫西林无法检测色谱峰，所建立的方法对血浆中阿莫西林和舒巴坦测定专一性强。用0.5mol/L高氯酸直接沉淀血浆蛋白，取上清液测定阿莫西林血浆药物浓度，方法简便，最低检测浓度能够满足阿莫西林血浆样本测定要求。用盐酸使血浆样本酸化，再用乙醚提取游离的舒巴坦，水浴蒸干后用流动相溶解进样，提高了舒巴坦血浆样本的最低检测浓度，满足了舒巴坦血浆样本测定要求。阿莫西林和舒巴坦血浆药物测定的方法平均回收率分别为96.25%和102.3%，日内、日间RSD均小于10%，该方法适合于阿莫西林和舒巴坦血浆药物浓度测定。对20名自愿受试者进行了不同时间的血药浓度的测定，进一步证明了该方法的可行性，也为阿莫西林和舒巴坦制剂的药物动力学和生物等效性转贴于 酷文网-论文下载中心 http://www.coolwen.net