早期给予黄芪注射液治疗大鼠脑出血对血肿周围胞凋亡的影响

    1.2.4 细胞凋亡的检测 取与免疫组化染色相邻切片，用末端脱氧核糖核苷转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)。在暗室内荧光显微镜下观片，在200倍视野下，随机观察并计数血肿周边3个不重复视野的TUNEL反应阳性细胞数目。

    1.2.5 结果分析 结果用x±s表示。统计学处理采用SPSS11.5软件包进行方差分析和相关分析，显著性水准均为α=0.05。   2 结果

    2.1 大鼠神经功能缺损评分 麻醉苏醒后，两组动物均出现不同程度神经功能缺损表现，根据Berderson评分标准对术后各组大鼠进行神经功能评分，各组评分情况见表1，神经功能变化情况见图1。表1 脑出血后各时相点神经功能评分 注：*P<0.01，VS ICH group

    2.2 TUNEL荧光染色 TUNEL荧光染色阳性细胞是核周染色质浓缩呈明亮点状的黄绿色细胞。ICH各组、各时间点凋亡细胞表达情况见表2。 表2 各组血肿周围区TUNEL阳性表达情况注：*P<0.01，VS ICH group; ★P>0.05，VS instantly treated group; △P>0.05，VS 12h group; ● P<0.01，VS instantly treated and 6h group

    2.3 Caspase-3免疫组化染色 Caspase-3染色阳性的神经细胞，胞浆呈棕黄色，高倍镜下观察Caspase-3表达显色深的神经细胞形态较为正常，细胞核尚完整。各治疗组均比出血对照组明显降低(P<0.01)，见表3。 表3 各组血肿周围区Caspase-3蛋白表达情况注：*P<0.01，VS ICH group; ★P<0.05， VS 6 h group; △P<0.01，VS 6h group; ●P<0.01， VS instantly treated group

    3 讨论

    脑出血是一种发病率、病死率和致残率均较高的临床常见病和多发病，迄今为止对脑出血的治疗虽较以往有很大进步，但脑出血急性期仍无肯定、有效的治疗方法，脑出血仍具有相当高的死亡率［2］。 有文献报道临床应用益气消肿药黄芪治疗急性期脑出血患者，取得了一定的效果［3］，但目前对于该药治疗脑出血的时机问题尚不清楚。近几年在脑出血的机制方面的研究取得了一定的进展；文献表明，脑出血后血肿周围脑组织血流量下降，相对于严重缺血性卒中而言属于轻中度脑缺血，轻微脑缺血伴随着大量激活的细胞因子外渗所导致的细胞凋亡，是脑出血后细胞死亡主要途径之一［4］。

    细胞凋亡是一个多步骤发生的受多基因调控的程序性细胞死亡，在很大程度上依赖天冬氨酸特异性半胱氨蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific protease， caspase)家族的激活。其中caspase-3是哺乳动物细胞凋亡中的关键酶，在细胞凋亡分子机制网络中居核心地位［5］。Nicholson等［6］ 研究发现敲除Caspase-3基因，大鼠神经系统及大脑发育过程中的程序性死亡被干扰，出现细胞增生发育失控。此结果表明Caspase-3在大脑细胞凋亡中起重要作用。本研究应用相邻切片分别进行Caspase-3免疫组化和TUNEL荧光染色，两者阳性细胞范围及时间变化基本一致。说明caspase-3在脑出血后神经细胞凋亡中起重要调控作用。

    脑出血后脑内血肿，中医认为离经之血，即为瘀血，治法也应活血化瘀。祖国医学认为血瘀是中风的本质，活血化瘀是治疗中风的根本大法，但在治疗时机上存在较大争议。有学者认为活血化瘀不论在早期先驱症状、发作期，还是恢复期均可应用。特别提出，在急性脑血管疾病中，控制出血，不是采取止血方法，而是应用活血止血、化瘀止血、理气止血等法。

    黄芪为传统的益气利水中药之一，含有丰富氨基酸，微量元素硒、铁、锌及黄酮、黄酮类似物、黄芪皂苷类和黄芪多糖等多种成分。据报道黄芪具有提高细胞免疫和体液免疫功能［7］，抗脂质过氧化、降低自由基生成或增加自由基清除、抗氧化及稳定细胞膜，增加组织细胞抗缺血缺氧能力［8，9］。

    本实验结果证明：（1）实验性ICH后使用黄芪注射液治疗有效。（2）6h治疗组和12h治疗组治疗效果优于其他组。从行为学表现来看，在术后12h、24h对大鼠进行神经功能评分，出血同时治疗组神经功能缺失症状明显轻于对照组，术后4天评分发现出血同时治疗组和6h治疗组神经功能明显好于出血对照组。从TUNEL阳性表达情况来看，各治疗组凋亡率低于出血对照组，出血后第4天时间点上6h治疗组与出血同时治疗组差异无显著性，但6h组凋亡率明显低于24h组（P<0.01），12h组与24h组比较差异无显著性（P>0.05）。在7天时间点上，手术同时治疗组和术后6h治疗组凋亡率都显著低于24h组（P<0.01）。从各组Caspase-3蛋白表达情况来看，各治疗组均比出血组明显降低（P<0.01），其中手术同时治疗组和术后6h治疗组都比24h治疗组明显降低（P<0.01），6h治疗组比12h治疗组阳性表达明显降低（P<0.05）。综上所述，黄芪注射液治疗实验性大鼠脑出血可明显减少血肿周围的细胞凋亡率，特别是6h内用药效果优于其他实验组。

    【参考文献】

    1 王永炎，刘柄林.中风病研究述评.中国中医急症，1995，4(2):51-55.

    2 Prasad K，Browman G，Srivastava A， et al.Surgery in primary supratentorial intracerebral hematoma:a meta-analysis of randomized trials.J Acta Neurol Scand，1997，95:103-110.

    3 杨丽阳，曾凯军，王致道. 黄芪注射液治疗脑出血临床观察. 中国中医急症，2002，11(6)：461.

    4 Kohji M，Wei M，Xiaoring W，et al. Evidence for apoptosis after intracerebral hemorrhage in rat striatum.J Cereb Blood Flow Metab，2000，20(2)：396-404.转贴于 酷文网-论文下载中心 http://www.coolwen.net