脑胶质瘤细胞系对细小病毒MVM和H1易感性的研究

【摘要】  　　［目的］ 测定人胶质瘤细胞系A172，U87MG，U138，U373，和鼠胶质瘤细胞系GL261与MT539对细小病毒MVM和H1的易感性，并观察野生型病毒在肿瘤细胞内部繁殖情况。［方法］ 体外培养肿瘤细胞，分别用不同剂量的MVM和H1病毒感染GL261，MT539和A172，U87MG，U138，U373细胞1h，继续培养5d，每天进行活细胞计数。空斑形成试验测定感染病毒（MOI = 0.1）5d后细胞内部及细胞培养上清中的病毒总量。［结果］ 与未感染细胞（对照）比较，U138，U373，GL261细胞在MOI 2和5的病毒剂量感染后活细胞数目明显减少， U87细胞数基本维持不变，A172和MT539细胞数轻微增加。MOI = 0.1的病毒剂量对细胞的作用与对照没有差异。空斑形成试验结果表明U373和GL261在MOI=0.1的病毒感染5d后细胞内和培养上清中总病毒量略高于初始病毒量，其它细胞的总病毒量均低于初始病毒量。［结论］ 不同胶质瘤对细小病毒的易感性不同，U138， U373，GL261细胞对细小病毒H1或MVM易感，U87细胞次之，A172和MT539细胞不敏感。U373和GL261细胞有弱的产生子病毒的能力。

【关键词】  脑胶质瘤　细小病毒　易感性　肿瘤治疗

　　Susceptibility of Glioblastoma Cells to Wild Type Parvoviruses MVM and H1

        Abstract: ［Purpose］ To evaluate the susceptibility of human glioma cell lines (A172, U87MG, U138, U373) and murine glioma cell lines (GL261 and MT539) to wild type parvoviruses H1, MVM and the replication ability of wild type virus in these tumor cells. ［Methods］GL261, MT539, A172, U87MG, U138 and U373 cells were infected with H1 and MVM virus respectively for 1 hour at different MOI and cultured for 5 days in vitro. The number of living cells were counted every day. Total amount of virus in cells and supernatant were examined by plaque assay (MOI=0.1) at the fifth day after infection. ［Results］ After infection with MOI 2 and 5, cell number of U138, U373, GL261 decreased markedly, U87MG unchanged and A172 and MT539 increased a litter in comparison with uninfected cells. There was no difference between the doses at MOI 0.1 and control. The total amount of viruses measured at fifth day after infection was lower or similar to the amount of initial in most cell lines. U373 and GL261 samples showed a slight increase of virus compared with initial. ［Conclusions］ Different cell lines show different susceptibility to infection. U138, U373 and GL261 are susceptibility to parvovirus infection in vitro; U87, medium and A172, MT539 are not susceptive. U373 and GL261 have weak potence of producing progeny virions.

    Key words: glioblastoma; parvovirus; susceptibility; cancer therapy

    恶性胶质母细胞瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，常规的治疗方法，如手术切除、放化疗等都远不能达到治疗要求。近年来新出现的一些治疗策略显示出良好的前景，这其中包括溶瘤病毒治疗。细小病毒H1和MVM对肿瘤细胞和转化细胞有选择性杀伤，而对正常细胞则无影响，即具有“亲瘤性”和“溶瘤性”，不整合到宿主的染色体中，迄今未发现对人类有致病性，其抗癌活性也在多种肿瘤和转化细胞内得到证实，因此非常有希望成为一个新的抗肿瘤制剂。本文测定了几种胶质母细胞瘤细胞系对野生型MVM和H1的易感性，探讨用细小病毒MVM和H1治疗胶质母细胞瘤的可能性。

    1 材料与方法

    1.1 材 料

    细胞系：4种人胶质瘤细胞系，A172、U87MG、U138和U373，以及2株鼠胶质瘤细胞系，GL261和MT539，指示细胞 NBE-324K 和A9为德国癌症研究中心肿瘤病毒学研究室赠送。MVM和H1病毒为德国癌症研究中心肿瘤病毒学实验室Dr. Rommelaere赠送。其他试剂购自SIGMA公司。

    1.2 方 法

    1.2.1 细胞培养

    A172、U87MG、GL261和MT539细胞在含10%小牛血清、2mM L-谷氨酸和抗生素的DMEM中培养， U138在10%小牛血清、2mM L-谷氨酸和抗生素的RPMI培养液中培养，U373在10%小牛血清，2mM L-谷氨酸和抗生素的MEM中培养。培养条件为37℃，5% CO2，90% 湿度。

    1.2.2 病毒易感性测定

    感染的前一天在6cm 细胞培养皿中培养2.5×105细胞，次日吸除培养液，加入0.4ml用不含血清的MEM稀释的病毒,病毒剂量为MOI (multiplicity of infection)0.1，2，5，每一剂量接种10盘细胞，置于37℃，5%CO2， 90%湿度孵箱,每隔10min轻轻摇动培养皿1次，以确保细胞与病毒的接触。1h后吸除病毒，加入4ml含10%血清的培养液培养5d，每天取出2盘细胞用台盼蓝染色计数。

    1.2.3 空斑形成试验

    用H1病毒感染指示细胞NBE-324K，用MVM病毒感染指示细胞A9，感染方法同上。预先准备48℃预热的2%顶层琼脂，37℃预热的2×MEM完全培养液(20%血清)，使用前按3:5混合，感染1h后吸除病毒，加入7ml琼脂和2×MEM混合液，待液体凝固后，置细胞培养箱培养5d。第6d加入3ml中性红染色( 染色液配制: 45ml 37℃预热的2×PBS，45ml 48℃预热的2%琼脂，6ml 中性红，用前混合)，12h后空斑计数。

    1.2.4 子病毒产生检测

    培养4×105肿瘤细胞，用MOI=0.1的病毒感染细胞1h，吸除病毒，加入4ml培养液，培养5d。收集细胞培养上清，直接进行空斑试验，细胞用胰酶消化下来，加入细胞裂解液( 50mM Tris.HCl，pH 8.7，0.5mM EDTA)， -80℃ 30min，37℃10min, 反复冻融3次,离心收集上清，稀释后进行空斑试验。将细胞及其培养上清中的病毒数相加得到每一样品的最后结果。

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