鼻咽癌放疗后化疗敏感性的变化

【关键词】  鼻咽肿瘤；肿瘤细胞,培养的；基因,mdr1；P-糖蛋白；放射治疗；化疗敏感性

　　［摘要］  目的  检测鼻咽癌CNE1细胞X射线照射前后多药耐药基因（mdr1基因）及其编码产物P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是否表达，以及化疗药物敏感性的变化。方法  利用RT-PCR、Western blotting和流式细胞仪（FCM）检测CNE1细胞X射线照射前后的mdr1基因和P-gp的表达及对柔红霉素（daunorubicin,DNR）的外排功能。结果  鼻咽癌CNE1细胞射线照射前mdr1基因、P-gp不表达；射线照射后较长时间内mdr1基因、P-gp均长时间表达。CNE1细胞射线照射后对DNR的蓄积作用略有降低。结论  鼻咽癌CNE1细胞X射线照射后化疗敏感性降低。
   
　　［关键词］  鼻咽肿瘤；肿瘤细胞，培养的；基因，mdr1；P-糖蛋白；放射治疗；化疗敏感性
   
　　The change of chemotherapy sensitivity of nasopharyngeal carcinoma cell after radiotherapy

　　［Abstract］  Objective  To examine the expression of multidrug resistance gene(mdr1) and P-glycoprotein(P-gp) in nasopharyngeal carcinoma(NPC) CNE1 cell before and after radiotherapy,as well as the changes of chemotherapy sensitivity.Methods  The expression of mdr1 gene and its protein P-gp was assayed by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blotting.Flow cytometry (FCM) was performed to examine the function of cell efflux to daunorubicin.Results  Expression of mdr1-mRNA and P-gp of CNE1 cell in long time after radiotherapy was found,but not before.Intracellular daunorubicin(DNR) accumulation of CNE1 cell decreased after radiotherapy.Conclusion  Irradiation decreases the chemotherapy sensitivity of CNE1 cell.

　　［Key words］  nasopharyngeal carcinoma;tumor cells,cultured;Genes mdr1;P-glycoprotein;radiotherapy;chemotherapy sensitivity
   
　　中晚期鼻咽癌的治疗原则为放疗、化疗综合治疗。按照化疗安排在放疗前、放疗同时和放疗后分为：诱导化疗、同步化疗和辅助化疗，目前上述各种匹配方法临床上都有应用。以前往往着眼于化疗后的MDR，但在射线照射后mdr1及P-gp的表达和功能尤其在鼻咽癌细胞及其基础研究较少。多药耐药基因（mdr1基因）扩增及其编码产物P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的过度表达是目前已发现的最重要的一种多药耐药（multidrug resistance，MDR）机制，大多数肿瘤MDR的发生被认为与mdr1有关。我们所说的MDR一般是指由化疗引起的，但放疗是否会引起MDR呢？本研究观察体外培养的鼻咽癌CNE1细胞X线照射前后mdr1基因和P-gp的表达和功能的变化。

　　1  材料与方法

　　1.1  细胞和材料  鼻咽癌细胞系CNE1(中山大学肿瘤研究所)，小牛血清（杭州四季青公司），RPMI1640基础培养基（Invitrogen公司），二甲基亚砜（DMSO）（广州化学试剂厂），PBS（博士德生物有限公司），柔红霉素（意大利Pharmacia & Upjohn S.p.A），P-gp单克隆抗体C219（Calbiochem-Novabiochem公司），辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（二抗）（晶美公司），DNA Marker（华美生物工程公司），低融点琼脂糖（Promega公司，华美生物工程公司分装），Taq Plus Ⅱ DNA聚合酶(Sangon公司)、PCR扩增缓冲液和dNTP（华美生物工程公司），各种限制性内切酶、连接酶等（Promega、Gibco、Clontech等公司），Trizol试剂盒（Invitrogen公司），mdr1基因及内参照基因三磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）PCR引物由上海生工公司合成，P-gp阳性对照来自第四军医大学消化研究所胃癌多药耐药细胞系HT70细胞裂解液。

　　1.2  细胞培养  用含10%小牛血清及1%双抗的RPMI1640培养基常规37.0 ℃、5% CO2培养箱中培养，0.25%胰酶消化、传代。射线照射后继续培养两周后，每隔4天消化一次细胞冻存用于RT-PCR检测和Western blotting分析。

　　1.3  射线照射  取指数生长期细胞进行射线照射。照射源：美国VARIAN 2300 C/D型双光子直线加速器；照射条件：应用X射线，剂量率200 cGy/min,照射剂量：4 Gy;照射野大小：15 cm×15 cm。照射前有物理室测量照射剂量率，并对培养皿进行衰减校正。把培养皿置于照射野中心。

　　1.4  RT-PCR检测  参照文献［1］方法。

　　1.5  Western blotting分析  亦参照文献［1］方法。

　　1.6  流式细胞仪检测  待细胞长满单层用于流式细胞仪检测：（1）取未经X射线照射的CNE1细胞作为阴性对照，以排除细胞自身发光；（2）分取未经X射线照射、经X射线照射4Gy后经2次传代的CNE1细胞，加入可自发红色荧光的柔红霉素［2］,使培养基中柔红霉素终浓度达2 μmol/L。经X射线照射，加入柔红霉素的CNE1细胞，作为阳性对照（3）2 h后0.25%胰酶消化收获细胞，冷PBS(0 ℃)吹洗、离心3次后，用500 μl冷PBS吹散细胞；（4）在流式细胞仪上检测（激发光源波长488 nm,滤过光源波长575 nm）。每个标本检测的细胞数超过10000个。

　　2  结果

　　2.1  RT-PCR结果  CNE1细胞X射线照射前均未观察到mdr1 mRNA的表达；X射线照射后mdr1 mRNA均长时间稳定表达（见图1）。

　　2.2  Western blotting 结果  CNE1细胞X射线照射前均未观察到P-gp的表达； X射线照射后P-gp基本上均长时间明显表达（见图2）。

　　2.3   FCM结果  FCM检测到：射线照射后CNE1的阳性细胞数不变，但细胞内的DNR平均荧光度略有降低。说明：CNE1细胞射线照射后对DNR的敏感性略有降低（见图3、4）。1:射线照射前的CNE1细胞;6:DNA Marker;2～5,7～10:转贴于 酷文网-论文下载中心 http://www.coolwen.net