作者：陈萍，陈元仲，吴勇，黄慧芳，李乃农
【摘要】 转化生长因子β（TGF-β）及其受体的基因突变已被证实在肿瘤形成中具有重要的作用，在许多肿瘤中都发现有TGF-βⅡ型受体（TβR-Ⅱ）表达异常或表达缺失。为了了解急性白血病患者TβR-Ⅱ基因是否存在异常，本研究应用大范围RT-PCR的方法分段扩增急性白血病原代细胞TβR-Ⅱ的编码序列，并结合序列测定技术，分别对6例急性白血病患者以及11例正常人TβR-Ⅱ的编码序列进行突变检测。全部患者经骨髓细胞形态检查符合FAB诊断标准且骨髓原始细胞≥90%。肝素抗凝骨髓4-5 ml，分离单个核细胞，用TRIZOL试剂提取总RNA，反转录后行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。回收目的片段，克隆到PGEM-T载体，进行序列的测定。结果显示：在检测的病人中有2例病人中存在TβR-Ⅱ的同种型，而此2例病人临床预后不良。结论：部分白血病病人存在TβR-Ⅱ的同种型，而且该同种型可能与预后有关。
【关键词】 急性白血病
Identification of the Isoform in Type Ⅱ Receptor of Transforming Growth Factor-beta in Patients with Acute Leukemia and Its Clinical Significance
Abstract Recent research indicates that TGF-β and type Ⅱ receptor (TβR-Ⅱ) play an important role in the pathogenesis of tumor. A high frequency of abnormalities in TβR-Ⅱ has been demonstrated in various cancers.To identify the mutation of TβR-Ⅱ in patients with acute leukemia，the bone marrow samples from 6 patients with acute leukemia and 11 normal individuals as control were detected by long-range RT-PCR.To detect a deletion in sequence of the TβR-Ⅱgene，the PCR products were cloned to T vector and then sequenced.The results showed that there was existance of the isoform of TβR-Ⅱ in 2 cases out of 6 patients with acute leukemia.These two patients had more poor prognosis than others.In conclusion，there was the isoform of TβR-Ⅱ in partial patients with acute leukemia，and the isoform may be related with prognosis.
Key words acute leukemia; TβR-Ⅱ; isoform receptor
TGF-β信号转导通路在调节多种细胞的增殖与分化、诱导细胞凋亡等方面具有重要的作用，有研究表明这一通路的紊乱可以导致多种肿瘤的发生［1］ 。TGF-β受体（TβR）有3种亚型即TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ和TβR-Ⅲ，其中TβR-Ⅱ和TGF-β具有较高的亲和力，在TGF-β介导的信号转导中起着重要的作用，在许多肿瘤如慢性淋巴细胞白血病、人类表皮T细胞淋巴瘤患者中［2-3］均观察到TβR-Ⅱ表达缺陷。目前对于急性白血病原代细胞是否存在TβR-Ⅱ缺陷未见报道。本研究通过应用大范围RT-PCR技术分段扩增急性白血病原代细胞 TβR-Ⅱ的编码序列，进行序列的测定，结合收集的病人的临床资料，初步探讨TGF-βⅡ型受体（TβR-Ⅱ）在急性白血病发病机制中所起的作用。
材料和方法
研究对象
实验组6例，男5例，女1例，平均年龄47±18.6岁（30-66岁），为2003年4月-2004年2月福建医科大学附属协和医院血液科住院或门诊白血病病人，均为初治患者，其中急性淋巴细胞白血病2例（均为L2），急性非淋巴细胞白血病4例（M1 2例，M2 1例，M5 1例）按FAB分型诊断明确，其骨髓原始细胞≥90%。正常对照组11例，男9例，女2例，年龄28±7.2岁（21-35岁），均为健康供髓者。
单个核细胞的制备
采集骨髓，以肝素（40 U/ml）抗凝。加入37℃温浴的2%甲基纤维素(华美公司产品)至其终浓度为0.1%，混匀，于37℃、5% CO2 培养箱中静置30分钟，吸取上层有核细胞层，铺于Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液上层（华美公司产品，比重1.077）（有核细胞层∶分离液=2∶1），室温667×g离心20分钟，吸取中间层细胞置于1/15 PBS，充分重悬，室温167×g离心5分钟，弃上清，重复用PBS洗涤2次，用所得细胞提取RNA。
细胞总RNA提取
采用TRIZOL（Life Technology公司产品）提取总RNA，具体操作步骤详见说明书，经紫外分光度计测定浓度和纯度，A260/A280达到2.0，电泳可见清晰的28s及18s两条带，提示RNA结构完整，-70℃保存备用。
逆转录反应
反应体系25 μl，内含细胞总RNA 2 μg，M-MLV（Promega公司产品）200 U，dNTP 20 nmol，RNasin （Promega公司产品）25 U，随机引物 （Promega公司产品）0.5 μg，5×逆转录缓冲液5 μl（Tris-HCl 250 mmol/L，pH 8.3，KCl 375 mmol/L，MgCl2 15 mmol/L，DTT 50 mmol/L）。37℃温育60分钟，95℃ 5分钟终止反应，-20℃保存备用。
PCR反应
反应体系25 μl参照文献[4］，采用高保真酶（NEB公司产品）。扩增条件：95℃预变性5分钟，后94℃变性50秒，62℃退火30秒，72℃延伸60秒，共35个循环，再72℃延伸10分钟。PCR引物由上海博雅公司合成。TβR-Ⅱ 5’ 端编码序列(TGR5)上游引物为 5’ -CTCGGTCTATGACGAGCAG-3’；下游引物为5’-ACGTGGAGCTGATGTCAGAG-3’，扩增产物片段为720 bp。TβR-Ⅱ 3’ 端编码序列(TGR3)上游引物为 5’-CTGCCCATTGAGCTGGACAC-3’；下游引物为5’-CTCCAGCTCACTGAAGCGTTCTG-3’，扩增产物长度902 bp。
PCR产物纯化及测序
回收PCR产物按割胶回收试剂盒说明书（上海生物工程公司）进行，将回收产物5 μl加适量溴酚蓝及水点样电泳，电压5 V/cm，电泳30分钟后，在紫外检测灯光下，可见相应位置有条带。纯化产物连接至T载体上（Promega公司产品），将所连接产物转化感受态大肠杆菌JM-109细胞，用牙签挑取数个白色菌落，采用PCR方法鉴定，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳可见目的基因扩增带，挑取该菌落加5 ml含氨苄的LB液体培养基，37℃振摇过夜。取1 ml含氨苄的LB液体培养基，送上海博雅公司进行DNA测序。转贴于 酷文网-论文下载中心 http://www.coolwen.net
当前位置:
载入中...
-> 在百度中搜索：
-> 在Google中搜索：